诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能

摘要

目的: 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.

方法: 采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列, 再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接, 构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt, 并进行酶切图谱分析和测序分析. 然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞, 检测荧光素酶的表达水平, 分析不同基因型启动子的活性差异.

结果: 成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt, 发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高, 升高132.1%, 差异有显著性(P <0.05), iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%, 差异无显著性(P >0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.

结论: iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: March 5, 2004
Revised: April 9, 2004
Accepted: April 29, 2004
Published online: September 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

诱导型一氧化氮合酶 (induced nitric oxide synthase, iNOS)基因启动子是已知最大最复杂的启动子之一, 他的表达受精密复杂的调控. 遗传易感性对基因的功能影响可表现在几个方面, 其中基因启动子突变后可直接影响他的功能活性, 表现为功能增强或减弱, 所表达的蛋白水平也可发生改变. 基础研究发现iNOS基因启动子-969处有G→C的多态性. 然而, 这一多态性的功能意义尚不清楚. 我们构建iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的荧光素酶报道重组质粒, 瞬时转染HepG2细胞, 分别测定荧光素酶的活性, 以研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的功能.

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5a菌株和HepG2细胞株由武汉同济医院肝病研究所细胞室保存; 荧光素酶报道基因质粒PGV-B2(4 818 bp)及PGV-B2-E质粒(6 391 bp)由日本熊本大学医学院心血管系Hirofumi Yasue 教授惠赠; 限制性内切酶Kpn I, Xho I, T4DNA连接酶(Promega); 高保真TaqDNA聚合酶(Pfu); LB培养基(Gibco); 质粒提取试剂盒, 低溶点琼脂糖, 脂质体Lipofectin(Promega), b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒(Pan Vera Corp); 荧光素酶检测试剂盒, b半乳糖苷酶检测试剂盒(Promega); PCR仪(Perkin Emer), 恒温水浴箱, 低温高速离心机, 恒温震荡培养摇床; CO₂细胞培养箱(德国Heraeus), 超净工作台, 倒置显微镜(日本Nikon), 细胞计数器, 荧光分光光度计F-4500(日本Hitachi)等.

1.2 方法

从GenBank下载人iNOS基因全部序列(GenBank accession, L09210), 设计启动子引物时, 在两端分别接上KpnI酶切序列GGTACC, XhoI酶切序列CTCGAG. 上游序列为S: 5'-GACGGTACCGAAGGAAATGAGTGGACAGTGG-3'(7 086-7 107), 下游序列为AS: 5'-GACCTCGAGAACAGTCAAACCAGGAAGAGACC-3'(8 453-8 431). 由上海生工公司合成.

1.2.1 重组质粒的构建筛选与鉴定: 模板DNA来自iNOS基因启动子-969G→C多态性GG和GC基因型患者DNA. PCR反应预变性94℃ 4 min, 主循环变性94 ℃ 50 s, 退火41 ℃ 1 min, 延伸72 ℃ 1 min 30 s, 23循环. 最后72 ℃延伸5 min. 2%琼脂糖(含EB)电泳鉴定片段大小. 用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化PCR产物, 得到iNOSwt和iNOSmt启动子片段. 常规法制备感受态DH5a细菌, 转化PGV-B2-E质粒后大量制备质粒. 再将PCR获得的启动子片段和PGV-B2-E载体质粒分别用Xho I和Kpn I酶切, 回收纯化. 最后将不同的启动子片段分别与PGV-B2-E质粒载体片段在T4 DNA连接酶的作用下连接, 得到构建的含启动子荧光素酶重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt. 将重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt分别转化感受态细菌DH5a, 阴性对照以TE替代连接产物. 阳性对照以PGV-B2-E质粒替代连接产物. 挑选中等大小的Amp抗性菌落, 接种于含Amp的LB液体培养基中振摇培养过夜. 用质粒小量制备试剂盒抽提质粒, 行PCR鉴定及酶切分析鉴定. 获得阳性克隆. 将iNOS基因启动子PCR扩增产物及选择经酶切和PCR鉴定阳性的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt, 送上海生物工程公司测序分析, 以证实构建成功.

1.2.2 脂质体介导的质粒转染细胞: 选择已鉴定的重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt阳性菌落, 细菌扩增后大量制备转染质粒, 溶于TE 50 uL, -20 ℃保存. 采用脂质体Lipofectin介导的转染技术, 将重组质粒转染HepG2细胞, 并与b-肌动蛋白驱动b-半乳糖苷酶报道质粒220 ng共转染, 作为内对照, 以控制转染效率. 室温下放置30 min, 以便形成DNA-脂质体复合物. 阳性对照组加PGV-B2-E质粒. 阴性对照组加PGV-B2 质粒. 将转染质粒的细胞培养28 h检测. 转染的细胞经3次冻融裂解(-80 ℃ 30 min, 室温10 min)后, 裂解的细胞液转移至离心管, 离心. 取上清, 按荧光素酶检测说明书加样. 用荧光分光光度计测定20 s内的光输出量. b-半乳糖苷酶的检测按说明书执行, 用分光光度计在410 nm处测定A值.

统计学处理 所获的数据用均值±标准差表示. 荧光素酶活性用裂解细胞提取物中每克蛋白荧光素光亮强度light u/g 表示. 启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)代表. 标准化相对光单位/A410=同一细胞提取物测得的平均荧光素酶活性/b-半乳糖苷酶活性. 采用Bonferroni方法进行统计处理, P <0.05则有统计学意义.

2 结果

2.1 PCR扩增目的片段的结果

应用PCR技术扩增iNOS基因启动子的全长达1 385 bp, 分别获得含iNOS基因野生和突变的启动子目的片段. 由于扩增的目的片段较长, 在PCR过程中易出现碱基错配, 所以采用了高保真Taq DNA聚合酶(Pfu). 在实验初期, PCR扩增经历了多次的失败. 经查阅文献和回顾设计引物的过程及改进实验程序, 终于扩增出所需的目的基因片段(图1).

图1 iNOS基因启动子PCR扩增结果. M: PCR Marker (237-1 543 bp), 1-4: PCR产物1 385 bp.

2.2 重组质粒

将所构建的重组质粒经单酶切(Kpn I)、双酶切(Kpn I 和Xho I)及质粒PCR扩增产物, 用1%的琼脂糖电泳(图2). 构建的重组质粒pPGV-iNOS经双酶切后呈现1 373 bp 和4 765 bp两条片段, 单酶切为呈现6 138 bp的一条带. 空质粒PGB-B2-E单酶切为6 391 bp的一条带. B泳道的产物约为1 kb, 与预计相符; C泳道的短片段于B泳道一致, 长片段与E泳道的产物一致, 而D泳道的产物稍落后于C和E泳道, 说明其长度大于5 kb. 结果证实iNOS基因启动子荧光报道重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功. 将测序碱基序列以Blast 的基因格式调人GeneBank比较, 经Sequencer软件分析, pPGV-iNOSwt和PGV-B2-iNOSmt的送检序列与GenBank查询结果完全一致. 说明重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt构建成功. 图3为部分测序的结果.

图2 重组质粒的酶切PCR鉴定结果. A: PCR Marker (377-1 543 bp); B: 重组质粒PCR; C: 质粒经Kpn I 和Xho I双酶切; D: 重组质粒经Kpn I单酶切; E空质粒经Kpn I单酶切; F: DNA Marker (λDNA/Hind III).

图3 部分iNOS基因启动子测序.

2.3 启动子功能活性分析

将启动子活性用标准化相对光单位(NRLU)表示. 启动子iNOSmt的活性为6.5×10⁴, 与对照基因启动子B2-E的活性相比显著升高, 升高132.1%, 差异有显著性(P <0.05). 启动子iNOSwt的活性为3.2×10⁴, 与对照基因启动子B2-E的活性相比升高14.3%, 差异无显著性(P >0.05). iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.

3 讨论

基因启动子为DNA链上能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA转录的序列, 是基因表达不可缺少的重要调控序列. 启动子位于结构基因的5'端, 只能近距离起作用, 有方向性, 空间位置恒定, 是转录起始的基本信号结构, 决定基因的转录效率. 因此, 当基因启动子DNA链上的碱基发生突变或插入缺失, 可影响基因的转录调控功能. 研究启动子的功能变化, 最常用的方法是构建启动子重组体质粒-瞬时转染分析法. 我们成功构建的iNOS基因启动子-969位点多态性的荧光素酶报道基因重组质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt, 用脂质体介导法转染人肝癌细胞株HepG2, 研究iNOS基因启动子-969G→C多态性的不同基因型启动子的功能活性差异.结果发现启动子iNOSmt的活性比对照基因启动子B2-E的活性显著升高, 差异有显著性. 启动子iNOSwt的活性比对照基因启动子B2-E的活性稍高, 差异无显著性. 表明iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强, GC基因型携带者比GG基因型携带者可能有更强的iNOS表达.

Jurgen et al[1]在1998年研究儿童严重疟疾患者与iNOS基因启动子-969G→C的多态性的关系中, 发现杂合子GC的频率为17%, 轻度疟疾患者杂合子GC的频率为30%, 认为这种频率的差异与iNOS基因启动子-969G→C的突变后对疟疾产生抵抗有关.他们推测杂合子GC基因型患者可能产生大量的NO, 对疟疾具有杀伤作用. 本结果初步证实了Jurgen et al的推测, iNOS基因启动子-969G→C的多态性导致该启动子的功能活性增强, 产生大量的NO, 发挥效应. 最近Morris et al[2]报道在iNOS基因启动子-756到-716位点之间有一个AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性与iNOS基因启动子的功能活性有关, 他们发现iNOS基因启动子为"+"等位基因时活性比启动子为"-"等位基因的活性高25倍. 认为在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性中, "+"等位基因携带者是iNOS基因高表达, 导致2型糖尿病患者出现并发症的原因. 本研究的结果与Morris的结果有相似之处, 即iNOS基因启动子多态性改变影响其功能活性. 为了区分iNOS基因启动子-969G→C多态性中是否存在iNOS基因启动子AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性位点, 将构建的iNOS基因启动子-969G→C位点多态性的荧光素酶报道基因重组体质粒pPGV-iNOSwt和pPGV-iNOSmt测序的结果, 输入GenBank进行对比分析, 未发现有AAAT/AAAAT的缺失/插入(-/+)多态性相同序列. 提示iNOS基因启动子的这两个多态性都影响该基因启动子的功能活性.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	Kun JF, Mordmüller B, Lell B, Lehman LG, Luckner D, Kremsner PG. Polymorphism in promoter region of inducible nitric oxide synthase gene and protection against malaria. Lancet. 1998;351:265-266.  [PubMed]  [DOI]

2.	Morris BJ, Markus A, Glenn CL, Adams DJ, Colagiuri S, Wang L. Association of a functional inducible nitric oxide synthase promoter variant with complications in type 2 diabetes. J Mol Med (Berl). 2002;80:96-104.  [PubMed]  [DOI]