基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2016. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2016-10-08; 24(28): 3970-3977
在线出版日期: 2016-10-08. doi: 10.11569/wcjd.v24.i28.3970
MiRNA-138-5p抑制人胰腺癌细胞增殖能力
王杰, 喻超, 周显飞, 江建新
王杰, 喻超, 周显飞, 江建新, 贵州医科大学附属医院肝胆外科 贵州省贵阳市 550004
王杰, 医师, 主要从事胰腺肿瘤相关的研究.
作者贡献分布: 王杰对此文作主要贡献; 此课题由王杰、喻超及江建新设计; 研究过程由王杰操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由周显飞提供; 数据分析由王杰与周显飞完成; 本论文写作由王杰完成.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, Nos. 81160311, 81572429, 81660483.
通讯作者: 江建新, 主任医师, 550004, 贵州省贵阳市云岩区贵医街28号, 贵州医科大学附属医院肝胆外科. jjx731003@163.com
电话: 027-88041911
收稿日期: 2016-08-05
修回日期: 2016-08-15
接受日期: 2016-08-23
在线出版日期: 2016-10-08

目的

探讨微小RNA(microRNA, miR)-138-5p对胰腺癌(pancreatic cancer, PC)细胞增殖能力的影响.

方法

分别构建稳定表达的lv-miR-138-U、lv-miR-138-KD以及lv-NC慢病毒载体, 并将慢病毒表达载体分别感染人PC细胞株PANC-1以及Capan-2; 将感染后的PC细胞在体外分别采用CCK-8实验、平板克隆实验以及EdU实验检测miR-138-5p对PC细胞增殖能力的影响; 并在体内建立裸鼠皮下成瘤模型, 模拟体内环境中miR-138-5p对PC细胞增殖能力的影响.

结果

成功地构建了重组慢病毒表达载体, 并成功感染PC细胞株PANC-1和Capan-2; CCK-8、平板克隆以及EdU实验结果均提示lv-miR-138-U组较lv-NC组增殖能力明显减弱(P<0.05), 而lv-miR-138-KD组较lv-NC组增殖能力明显增强(P<0.05); 体内裸鼠皮下成瘤实验显示, 过表达miR-138-5p可以抑制PC细胞皮下成瘤的能力.

结论

miR-138-5p可以抑制人PC细胞的增殖, 为PC的治疗提供了潜在的治疗靶点.

关键词: miR-138-5p; 胰腺癌; 增殖

核心提要: 微小RNA(microRNA, miR)-138-5p在胰腺癌(pancreatic cancer, PC)中低表达, 且与PC细胞增殖能力相关, miR-138-5p可能扮演抑癌基因的角色抑制PC细胞的增殖.
引文著录: 王杰, 喻超, 周显飞, 江建新. MiRNA-138-5p抑制人胰腺癌细胞增殖能力. 世界华人消化杂志 2016; 24(28): 3970-3977
MiRNA-138-5p inhibits proliferation of pancreatic cancer cells
Jie Wang, Chao Yu, Xian-Fei Zhou, Jian-Xin Jiang
Jie Wang, Chao Yu, Xian-Fei Zhou, Jian-Xin Jiang, Department of Hepatic-Biliary-Pancreatic Surgery, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, Nos. 81160311, 81572429 and 81660483.
Correspondence to: Jian-Xin Jiang, Chief Physician, Department of Hepatic-Biliary-Pancreatic Surgery, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 28 Guiyi Street, Guiyang 550004, Guizhou Province, China. jjx731003@163.com
Received: August 5, 2016
Revised: August 15, 2016
Accepted: August 23, 2016
Published online: October 8, 2016

AIM

To investigate the effect of microRNA-138-5p (miR-138-5p) on the proliferation of pancreatic cancer (PC) cells.

METHODS

We constructed lentiviral vectors for miR-138-5p overexpression or knockdown and a negative control lentiviral vector, and transfected them into human PC cell lines PANC-1 and Capan-2. Cell counting kit-8 assay (CCK-8), colony-forming assay and EdU incorporation assay were employed to detect cell proliferation in vitro. The PANC-1 and Capan-2 cells were implanted subcutaneously in Balb/c nude mice to detect cell proliferation in vivo.

RESULTS

Lentiviral vectors were successfully constructed and transfected. CCK-8 assay, colony-forming assay and EdU incorporation assay showed that overexpression of miR-138-5p inhibited cell proliferation compared with the negative control (P < 0.05), while miR-138-5p knockdown promoted cell proliferation compared with the negative control (P < 0.05). In addition, miR-138-5p suppressed tumor growth in the subcutaneous xenograft model of human PC cells in Balb/c nude mice.

CONCLUSION

Our results indicate that miR-138-5p inhibits the proliferation of PC cells, suggesting a potential new therapeutic agent for PC.

Key Words: miR-138-5p; Pancreatic cancer; Proliferation
0 引言

胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是当前最致命的消化系恶性肿瘤之一, 在美国其致死率在所有恶性肿瘤中占第4位[1]. 而在我国, 随着生活、社会环境的变化, PC的患病率开始逐年上升[2]. PC早期不易诊断, 恶性程度高, 预后能力差, 对放化疗治疗不敏感, 故死亡率极高, 据统计PC的5年生存率不足5%[3,4]. 然而miRNA的异常表达与PC肿瘤的发生、发展密切相关, 有望成为PC诊治的新靶点[5]. 研究[6-8]表明, miRNA在细胞的正常生命周期中发挥至关重要的作用. miR-138-5p在多种肿瘤细胞(如结肠癌、尤文肉瘤、肾癌、黑色素瘤)中呈低表达, 上调miR-138-5p能抑制肿瘤细胞的增殖[9-12]. 我们前期研究[13]表明miR-138-5p在PC中呈低表达. 本研究前期已成功构建lv-miR-138-5p并已验证感染效率[13], 本次实验通过体内体外两方面分别验证miR-138-5p对PC细胞增殖的影响, 为深入探讨其机制提供一定的理论基础.

1 材料和方法
1.1 材料

1.1.1 细胞株和制剂: 人PC细胞系购自美国ATCC细胞库; 慢病毒载体由上海吉凯公司负责包装和构建; CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所; Cell-LightTM EdU Apollo® 567 In Vitro Imaging Kit购自广州锐博生物科技有限公司; Ki67抗体购自美国CST公司.

1.1.2 动物: Balb/c nude mice(免疫缺陷小鼠)购自北京华阜康生物科技股份有限公司, ♀, 周龄4 wk, 体质量14-15 g.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组: PC细胞Capan-2采用RPMI 1640培养基(含10%FBS), 置于37 ℃、50 mL/L CO2恒温培养箱培养, PANC-1采用高糖DMEM培养基(含10%FBS), 置于37 ℃、50 mL/L CO2恒温培养箱培养. 待其贴壁生长至70%-80%融合时, 用0.05%胰酶消化传代培养. 按慢病毒感染手册感染PC细胞. 实验分3组: lv-NC组、过表达组lv-miR-138-U以及抑制组lv-miR-138-KD.

1.2.2 CCK-8检测miR-138-5p对PC细胞增殖活性的影响: 制备细胞悬液, 调整细胞密度为1×105个/mL; 接种到96孔板中, 每孔约100 μL细胞悬液, 每个样约5个副孔; 分别于24、48、72、96 h加入含10%CCK8的培养液; 培养3 h, 测定波长为450 nm时每孔的吸光度.

1.2.3 Edu检测miR-138-5p对PC细胞增殖能力的影响: 细胞转染48 h后, 换用50 μmol/L EdU培养液孵育2 h, 4%多聚甲醛室温固定30 min. 按照Cell-LightTM EdU Apollo® 567 In Vitro Imaging Kit说明书步骤染色. 染色完成后荧光显微镜观察并拍照记录, 重复3次实验, 计算Apollo染色阳性细胞与Hoechst染色阳性细胞的比值.

1.2.4 平板克隆实验检测miR-138-5p对PC细胞克隆形成的影响: 收集对数生长期细胞, 调整细胞悬液浓度为1×103个/mL, 于六孔板中种植2000个细胞, 37 ℃培养箱中培养7-8 d后40 g/L多聚甲醛固定30 min, 0.1%结晶紫染色30 min, 计数每孔克隆形成数量并拍照记录.

1.2.5 裸鼠皮下成瘤模型检测miR-138-5p对PC细胞体内成瘤的影响: 将裸鼠随机分成两组: 阴性对照组(lv-NC组)与过表达组(lv-miR-138-U组). 分别收集对数生长期稳定表达的细胞, 用PBS重悬后弃上清, 再将PBS与Matrigel按1:1体积混合, 用混合液重悬调整细胞浓度为1×107个/mL. 于每只裸鼠的右后腿部皮下注射200 μL细胞悬液. 在相同条件下(间断12 h光照与黑暗, 自由进食等)饲养6 wk, 观察1次/wk裸鼠, 并做好相应记录(体质量、肿瘤大小). 6 wk后采用颈部脱臼法处死裸鼠, 解剖裸鼠取出肿瘤并拍照记录.

1.2.6 免疫组织化学法检测裸鼠肿瘤相关增殖指标的变化: 将解剖的裸鼠肿瘤组织用40 g/L多聚甲醛固定, 石蜡包埋, HE染色; 将细胞增殖相关蛋白Ki67按1:400稀释后染色. 每组肿瘤切片随机选取5张切片, 每张切片随机选取5个视野, 观察并拍照记录.

统计学处理 采用SPSS19.0对实验数据进行分析、整理, 计量资料采用mean±SD, 两组间分析采用t检验, 各组间差异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA), P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果
2.1 miR-138-5p对PC细胞增殖活性的影响

CCK-8结果显示, 当培养72 h和96 h后, lv-miR-138-U组细胞增殖活性为PANC-1: 72 h: 0.75±0.06, 96 h: 1.04±0.07; Capan-2: 72 h: 1.00±0.05, 96 h: 1.16±0.05; lv-NC组增殖活性为PANC-1: 72 h: 0.97±0.07, 96 h: 1.44±0.05; Capan-2: 72 h: 1.30±0.03, 96 h: 1.56±0.04; lv-miR-138-KD组增殖活性为PANC-1: 72 h: 1.38±0.06, 96 h: 2.04±0.05; Capan-2: 72 h: 1.80±0.09, 96 h: 2.14±0.07; lv-miR-138-U组较lv-NC组增殖活性明显减弱, 而lv-miR-138-KD较lv-NC组增殖活性明显增强, 差异均有统计学意义(P<0.05)(图1).

图1
图1 CCK-8检测miR-138-5p对胰腺癌细胞增殖活性的影响. A: PANC-1细胞株各组在各时间点的细胞活力; B: Capan-2细胞株各组在各时间点的细胞活力. aP<0.05 vs lv-NC组.
2.2 miR-138-5p对PC细胞增殖能力的影响

EdU实验结果显示: Apollo染色阳性细胞与Hoechst染色阳性细胞比值分别为lv-miR-138-U组: PANC-1: 0.27±0.05; Capan-2: 0.19±0.02; lv-NC组: PANC-1: 0.55±0.05; Capan-2: 0.50±0.03; miR-138-KD组: PANC-1: 0.79±0.03; Capan-2: 0.82±0.02; lv-miR-138-U较lv-NC组增殖能力明显减弱, 而lv-miR-138-KD较lv-NC组增殖能力明显增强, 差异均有统计学意义(P<0.05)(图2).

图2
图2 EdU检测miR-138-5p对胰腺癌细胞增殖能力的影响. A: PANC-1 NC组; B: PANC-1 miR-138-U组; C: PANC-1 miR-138-KD组; D: Capan-2 NC组; E: Capan-2 miR-138-U组; F: Capan-2 miR-138-KD组; G: PANC-1细胞株各组间增殖阳性率; H: Capan-2细胞株各组间增殖阳性率. aP<0.05 vs NC组.
2.3 miR-138-5p对PC细胞克隆形成的影响

平板克隆实验结果显示: 集落形成数量分别为; lv-miR-138-U组: PANC-1: 39.67±3.28; Capan-2: 292.70±11.35; lv-NC组: PANC-1: 84.33±5.21; Capan-2: 441.30±24.23; lv-miR-139-KD: PANC-1: 218.00±14.57; Capan-2: 797.70±29.87; lv-miR-138-U组较lv-NC组集落形成数量明显减少, 而lv-miR-138-KD组较lv-NC组集落形成数量明显增多, 差异均有统计学意义(P<0.05)(图3).

图3
图3 平板克隆检测miR-138-5p对胰腺癌细胞集落形成的影响. A: PANC-1 lv-NC组; B: PANC-1 lv-miR-138-U组; C: PANC-1 lv-miR-138-KD组; D: Capan-2 lv-NC组; E: Capan-2 lv-miR-U组; F: Capan-2 lv-miR-138-KD组; G: PANC-1细胞株各组间集落形成数; H: Capan-2细胞株各组间集落形成数. aP<0.05 vs lv-NC组.
2.4 miR-138-5p对PC细胞在体内实验中的成瘤影响

裸鼠饲养6 wk后, 取出肿瘤, 通过测定肿瘤体积(mm3), 肿瘤体积分别为lv-miR-138-U组: PANC-1: 297.2±27.77; Capan-2: 158.20±10.76; lv-NC组: PANC-1: 700.40±44.34; Capan-2: 480.20±31.09; lv-miR-138-U组较lv-NC组肿瘤体积明显变小, 差异均有统计学意义(P<0.05)(图4).

图4
图4 miR-138-5p对胰腺癌细胞皮下成瘤能力的影响. A: PANC-1 lv-NC组; B: Capan-2 lv-NC组; C: PANC-1 lv-miR-138-U组; D: Capan-2 lv-miR-138-U组; E: 各组间瘤子的体积大小. aP<0.05 vs lv-NC组.
2.5 miR-138-5p对肿瘤增殖相关指标的影响

免疫组织化学结果显示: lv-miR-138-U组Ki67的表达量明显低于lv-NC组(图5).

图5
图5 免疫组织化学检测瘤子增殖指标Ki67的变化(400×). A: PANC-1 lv-NC组; B: PANC-1 lv-miR-138-U组; C: Capan-2 lv-NC组; D: Capan-2 lv-miR-138-U组.
3 讨论

MicroRNA是一组由19-22个核苷酸组成的内源性非编码小RNA, 他能通过与靶mRNA的3'UTR特异性结合, 在转录后水平调控基因的表达[6-8]. MiRNA的异常表达与疾病的进展及演变乃至肿瘤形成都密切相关, 且扮演了重要的角色[14].

据报道miR-138在众多肿瘤组织中低表达, 其中包括结肠癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌以及胆管癌[15-18]. 仅有少数研究[19]显示miR-138能够促进肿瘤的生长. miR-138被誉是一种抑癌基因, 当下调miR-138的表达, 结肠癌的淋巴转移增强, 远处转移增多, 预后不良. 但高表达的miR-138能在体内体外实验中抑制结肠癌的侵袭转移和增殖能力[15]. 已有文献报道, miR-138能通过作用于"癌蛋白"YAP1, 他是Hippo信号通路下游的重要调控蛋白, 主要参与细胞的生长、增殖、修复及内环境的稳定, 异常表达的YAP1促进多种肿瘤的增殖, 而miR-138通过抑制其表达从而抑制肺小细胞癌的增殖能力[19]. Liu等[20]采用双荧光素酶报告分析确定SOX9是miR-138直接作用的靶蛋白, 并采用qRT-PCR和Western bolt证实过表达的miR-138能抑制SOX9的表达, 上调miR-138或者下调SOX9的表达均能抑制肝癌细胞的增殖. Jiang等[21]通过一系列体外实验表明miR-138能抑制骨肉瘤细胞的增殖, 同样采用双荧光素酶报告确定DEC2是miR-138直接作用的靶蛋白, 参与调控骨肉瘤的增殖. 在宫颈癌与胆囊癌的报道中, Li等[22]和Ma等[23]分别证实miR-138能够通过调控c-Met和Bag-1抑制宫颈癌和恶性黑色素瘤的增殖. 在PC中, miR-138相关报道较少, 其靶基因并不明确, 我们前期研究[13]表明miR-138-5p在PC中低表达, 并可能通过EMT途径参与调控PC细胞的侵袭转移. 为了进一步探讨miR-138-5p影响PC细胞增殖的作用机制, 我们课题组从生物信息网站(TargetScan等)预测并筛选出FOXC1基因. 转录因子叉头框蛋白C1(forkhead box C1, FOXC1)主要参与中胚层的发育, 也有研究表明FOXC1与乳腺癌[24-26]、垂体瘤[27]、卵巢癌[28]的发生发展有关. FOXC1在PC中的报道甚少, 我们前期通过研究[29]证实沉默FOXC1能抑制PC细胞的增殖, 其部分机制可能通过调控周期蛋白Cyclin D1的表达而影响增殖. miR-138-5p的直接作用靶蛋白是否是FOXC1还需进一步实验证实. 另一方面, 影响PC细胞增殖的主要信号通路包括MAPK通路[30]、Hedgehog通路[31]、PI3K/AKT通路[32]等, miR-138-5p是否参与激活上述通路影响PC细胞增殖还需进一步实验探究.

为了研究miR-138-5p对PC增殖能力是否有影响, 本课题组分别从体外、体内两方面进行着手研究, 体外采用CCK-8实验证实miR-138-5p能够减弱PC细胞的增殖活性; EdU实验证实miR-138-5p能减弱PC细胞的增殖能力、平板克隆实验证实miR-138-5p能减少集落形成的数量. 进一步采用裸鼠皮下成瘤实验证实miR-138-5p能明显抑制肿瘤生长. 故可以得出结论, miR-138-5p与PC细胞增殖能力相关, 且可能扮演抑癌基因的角色抑制PC细胞的增殖.

总之, 本研究发现miR-138-5p在PC中是作为抑癌基因形式存在, 能显著抑制PC细胞的体外增殖以及体内成瘤, 这为进一步深入探究其机制提供了理论基础, 有望成为PC诊治的新靶点.

评论
背景资料

胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是一种高度恶性的消化系肿瘤, 其发病率逐年上升, 早期不易诊断, 治疗及预后效果极差是导致高死亡率的关键因素. miRNA参与肿瘤的发生发展, 研究miRNA与肿瘤的发病机制对治疗PC具有重要意义.

同行评议者

李刚, 教授, 北京大学医学部生物化学与分子生物学系; 吴道澄, 教授, 西安交通大学生命学院

研发前沿

miR-138在众多肿瘤中扮演抑癌基因的角色, 抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移等. 而miR-138-5p在PC中很少报道, 深入研究miR-138-5p在PC中的作用以及机制可进一步对PC的治疗提供理论基础.

相关报道

有研究报道, miR-138的异常表达可促进肿瘤的增殖和侵袭. 过表达miR-138后与其直接相关的目的靶基因SOX9、DEC2、c-Met等的表达受到抑制, 肿瘤增殖能力减弱.

创新盘点

PC的相关文献报道中, miR-138的研究甚少, 其作用机制仍不清楚, 本实验主要探讨miR-138-5p对PC细胞增殖是否有影响, 为进一步探讨相关机制提供理论基础.

应用要点

本研究发现, miR-138-5p在PC中是一种抑癌基因, 其过表达能抑制PC细胞增殖, 为PC的治疗提供新的治疗靶点.

名词解释

微小RNA(miRNA): 是一组由19-22个核苷酸组成的内源性非编码小RNA, 他能通过与靶mRNA的3'UTR特异性结合, 在转录后水平调控基因的表达, 参与细胞正常的生命周期及肿瘤的发生与发展.

同行评价

本文立意清晰, 实验方法成熟, 所得结果明确, 具有一定的学术价值.

手稿来源: 自由投稿

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 贵州省

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): B

C级 (良好): C

D级 (一般): 0

E级 (差): 0

编辑:马亚娟 电编:胡珊

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