修回日期: 2013-12-30
接受日期: 2014-01-08
在线出版日期: 2014-02-18
目的: 采用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption inhibition time of flight ionization mass spectrometry, SELDI-TOF-MS)检测肝癌易发家系患者和无癌家系患者血清蛋白生物标志物, 比较两者间的蛋白差异, 建立筛选血清蛋白质图谱模型并初步验证.
方法: 选择30例肝癌易发家系患者, 30例无癌家系患者, 应用SELDI-TOF-MS技术及相应的计算机软件进行比较分析, 检测肝癌易发家系患者血清蛋白质的特异性生物标志, 建立肝癌易发家系患者的筛选模型, 并对其进行了双盲法验证.
结果: 肝癌易发家系组与对照组共有20个蛋白质差异有显著性, 以其中4个蛋白标志物(9645.48、3960.65、7895.66和5916.07 kDa), 建立的筛选模型检测灵敏度为93%(28/30), 特异性为90%(27/30), 准确率为92%(55/60). 盲法验证, 灵敏度为92%(23/25), 特异性为90%(18/20).
结论: SELDI-TOF-MS技术具有高灵敏度和特异性, 在肝癌易发家系的血清蛋白特异性生物标志物的筛选等方面具有较好的应用前景.
核心提示: 本研究筛选出的20个有统计学意义的差异性蛋白峰可能就是我们要寻找的遗传性蛋白质峰, 肝癌易发家系组与无癌家系组在血清蛋白组学方面确实存在差异, 再次验证原发性肝癌的发生与遗传具有密切相关性.
引文著录: 邓敬桓, 陈智平, 李山, 秦雪, 黄东萍. 应用SELDI-TOF-MS技术筛选肝癌遗传性血清蛋白标志物. 世界华人消化杂志 2014; 22(5): 690-694
Revised: December 30, 2013
Accepted: January 8, 2014
Published online: February 18, 2014
AIM: To detect specific serum biomarkers for liver cancer using surface enhanced laser desorption inhibition time-of-flight ionization mass spectrometry (SELDI-TOF-MS), and establish a serum protein pattern for screening liver cancer prone families.
METHODS: Serum samples collected from 30 patients from liver cancer prone families and 30 patients from liver cancer-free families were detected by SELDI-TOF-MS. The data were analyzed was Biomarker Wizard and BPS software to establish a serum protein pattern for screening liver cancer prone families. The pattern was evaluated by a blind test.
RESULTS: A total of 20 peaks showed significant differences between the two groups, among which 4 (9645.48, 3960.65, 7895.66, 5916.07 kDa) were chosen to establish a serum protein pattern for screening liver cancer prone families. The accuracy, sensitivity and specificity of the pattern were 92% (55/60), 93% (28/30) and 90% (27/30), respectively. The blind test showed that the sensitivity and specificity were 92% (23/25) and 90% (18/20), respectively.
CONCLUSION: SELDI-TOF-MS has a high sensitivity and specificity in screening specific hereditary serum biomarkers for liver cancer.
- Citation: Deng JH, Chen ZP, Li S, Qin X, Huang DP. Detection of hereditary serum markers for liver cancer using SELDI-TOF-MS protein chip technology. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2014; 22(5): 690-694
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v22/i5/690.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v22.i5.690
肝癌易发家系包括肝癌高发家系和肝癌非高发家系, 相关研究表明[1], 肝癌的发生发展是多因素参与的多环节的病理过程, 除了与病毒寄生虫和细菌的感染、黄曲霉毒素的摄入、水源污染以及吸烟喝酒这些外环境致癌因素有关, 自身遗传因素也具有一定的相关性. 本实验采用表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱技术, 以肝癌无癌家系为参照, 筛选出肝癌遗传性的血清蛋白标志物, 为将来建立能够判断肝癌易发家系发生肝癌危险性的预测体系奠定基础.
肝癌易发家系包含肝癌高发家系和肝癌非高发家系两类. 肝癌高发家系: 直系亲属中发生过2例或2例以上原发性肝癌病例的家系. 肝癌非高发家系: 直系亲属中发生过1例原发性肝癌病例的家系. 无癌家系: 直系亲属中未发生过任何恶性肿瘤病例的家系. 广西医科大学在承担国家"六五"和"七五"攻关课题时, 已在肝癌高发区建立了癌症登记网, 掌握了肝癌高发区中肝癌高发家系、肝癌非高发家系和无癌家系成员名单, 在患者经病理或临床诊断确诊且未经治疗的情况下说明了采血的要求, 给予知情权, 并征得研究对象同意, 在2010-01/2013-03期间, 采集到肝癌高发家系患者30例血清, 肝癌非高发家系患者25例血清, 肝癌无癌家系患者50例血清. 其中以相同的生活环境、生活习惯、相同职业、相同民族、相同性别、年龄±5岁作为配对条件, 选取肝癌高发家系患者15例, 肝癌非高发家系患者15例作为肝癌易发家系组, 对照组肝癌无癌家系患者30例, 用于筛选模型的建立, 剩余样本用于所建模型的双盲法验证. 尿素、3-环乙胺-1-丙磺酸、乙腈、二硫苏糖醇、醋酸钠、三氟乙酸、羟乙基哌嗪乙磺酸、芥子酸、超纯水均购自美国西格玛(Sigma)公司; 蛋白芯片生物系统及CM10芯片购自美国赛弗吉(Ciphergen)公司.
1.2.1 样品收集与预处理: 所有血样均于清晨空腹采集, 放置4 ℃冰箱2 h后, 1000 r/min离心10 min, 冰浴上分装血清于-80 ℃低温冰箱保存备用. 检测前取出血清样品, 置冰盒上溶解; 以1000 r/min, 4 ℃离心2 min; 取血清10 µL, 加入2倍体积9 mol/L Urea缓冲液(含DTT)稀释, 将样品冰浴震荡30 min; 将30 µL上述变性后样品加入360 µL的50 mmol/L NaAC(pH 4.0)缓冲液, 立即混匀.
1.2.2 芯片预处理、上样和洗脱: 将CM10芯片装入生物芯片处理器, 每孔加入200 µL 50 mmol/L NaAC(pH 4.0)缓冲液, 震荡5 min, 甩掉缓冲液. 重复上述操作一次. 在芯片处理器每孔中加入100 µL处理好的样品, 4 ℃震荡1 h; 弃去未结合样品, 每孔加入200 µL的NaAC缓冲液, 震荡5 min, 甩去孔中液体, 重复操作一次; 每孔加入200 µL 1 mmol/L HEPES, 然后立刻甩出; 取出芯片待干后, 在每个加样孔上加SPA 0.5 µL; 待干后, 重复加SPA一次.
1.2.3 芯片检测、数据采集和参数设置: 采用PBS Ⅱ C型蛋白芯片生物系统读取芯片信息. 用加有标准蛋白质的All-in-one芯片校正仪器. 芯片阅读仪参数设置如下: 激光强度185, 检测灵敏度8, 优化范围2000-10000, 最高相对分子质量50000, 芯片上的每个点采集130次.
1.2.4 分析差异蛋白: 用Proteinehip Software3.2 Software(BPS)对图谱进行标准化后, 筛选出有统计学意义的差异蛋白峰, 然后用Biomarker Wizard软件快速计算出有统计学意义相同相对分子质量的蛋白在肝癌易发家系组与对照组间峰值差异的表达强度, 最后以肝癌无癌家系组的蛋白质平均强度数值为参照进行比对两组差异蛋白质的表达变化.
1.2.5 诊断模型的建立与验证: 用Biomarker Pattern软件对两组间相同相对分子质量的差异表达蛋白峰值做线性分类分析, 经过进一步优化实验参数, 确定最佳的分类模型, 即诊断模型并输出原始判别结果, 用BPS进行交叉验证并输出结果, 以交叉验证为最终结果.
1.2.6 盲筛法验证诊断模型用剩余样本: 肝癌易发家系25例, 其中肝癌高发家系15例、肝癌非高发家系10例, 肝癌无癌家系组20例, 对上述建立的诊断模型进行盲法验证(masked analysis), 验证该模型的特异性和灵敏度.
统计学处理 数据的统计分析由统计软件包SPSS10.0完成. 两组间比较用t检验, P<0.05为差异有统计学意义.
在相对分子质量2000-50000范围内共检测到45个蛋白质峰, 其中20个在两组间的比较差异有统计学意义(P<0.05, 表1).
| 差异蛋白峰的相对分子质量 | P值 | 蛋白质平均强度 | 差异蛋白质的表达变化 | |
| 肝癌易发家系组 | 肝癌无癌家系组 | |||
| 4700.91 | 0.00 | 1.13 | 3.62 | ↓ |
| 9125.89 | 0.00 | 1.89 | 3.21 | ↓ |
| 5317.22 | 0.00 | 4.65 | 8.04 | ↓ |
| 4856.19 | 0.00 | 3.14 | 2.28 | ↑ |
| 9645.48 | 0.00 | 28.1 | 4.95 | ↑ |
| 8282.61 | 0.00 | 4.12 | 6.16 | ↓ |
| 7679.40 | 0.00 | 3.74 | 4.11 | ↓ |
| 3960.65 | 0.00 | 0.27 | 3.58 | ↓ |
| 9179.55 | 0.00 | 8.11 | 6.96 | ↑ |
| 4760.91 | 0.00 | 4.39 | 2.85 | ↑ |
| 5916.07 | 0.00 | 3.35 | 10.65 | ↓ |
| 7554.67 | 0.00 | 1.95 | 1.15 | ↑ |
| 7895.66 | 0.00 | 11.49 | 3.27 | ↑ |
| 4598.00 | 0.00 | 23.47 | 27.60 | ↓ |
| 6315.22 | 0.00 | 10.54 | 6.96 | ↑ |
| 2742.85 | 0.00 | 8.05 | 5.29 | ↑ |
| 4681.23 | 0.00 | 1.18 | 2.47 | ↓ |
| 7847.62 | 0.00 | 3.14 | 1.57 | ↑ |
| 3565.86 | 0.00 | 3.89 | 1.78 | ↑ |
| 5701.52 | 0.01 | 2.71 | 4.92 | ↓ |
将这些差异峰用BPS软件进行分析, 自动选取其中4个差异峰(9645.48、3960.65、5916.07、7895.66 kDa), 模型中的4个蛋白所占的重要分值(表2), 建立了筛选肝癌易发家系的诊断模型(图1), 此模型的根节点为9645.48 kDa, 首先根据此峰值强度, 28例标本被划分到左侧的枝结点, 32例被划分到右侧的枝结点, 又根据3960.65、5916.07、7895.66 kDa的峰值强度, 将标本进一步划分, 最终将60例标本划分开. 经交叉验证该模型区分肝癌易发家系组和肝癌无癌家系组, 30例肝癌易发家系组有28例被正确划分, 30例肝癌无癌家系组有27例被正确划分, 该模型检测灵敏度为93%(28/30), 特异性为90%(27/30), 准确率为92%(55/60). 用该模型对肝癌易发家系25例(其中肝癌高发家系15例、肝癌非高发家系10例), 肝癌无癌家系组20例进行盲法验证, 23例肝癌易发家系, 18例肝癌无癌家系被区分正确, 盲法验证, 灵敏度为92%(23/25), 特异性为90%(18/20).
| Variable(变量) | Score(分值) | 蛋白所占分值具体图示 |
| M9645_48 | 100.00 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
| M3960_65 | 87.62 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |
| M5916_07 | 67.40 | |||||||||||||||||||||||||||| |
| M7895_66 | 44.83 | ||||||||||||||||||| |
蛋白质组是连接基因序列与细胞功能的桥梁. 近年来, 人们认识到仅通过DNA序列来解释生物功能是不可能的, 蛋白质才是生命功能的主要执行者. 而蛋白质组的研究方法现已广泛应用于临床各领域的研究[2]. 特别是对原发性肝癌的发生、发展等方面的相关研究.
原发性肝癌的发生是多因素相互作用, 多途径多步骤长期作用的结果, 有外部的环境因素包括病毒感染, 黄曲霉毒素, 农村饮用水的污染, 饮酒、吸烟, 幽门螺旋杆菌肝吸虫感染等[3-8]; 而内部因素如自身的遗传因素, 在原发性肝癌的发生机制方面也起了非常重要的作用. 广西医科大学在承担国家"六五"和"七五"攻关课题以及进行的一系列研究中发现, HBV感染是广西肝癌高发的主要致病因子在相同民族、相同生活环境、生活水平、生活习惯和生活条件下, 出现癌家族聚集性[9], 为揭示这一流行病学现象. 本实验从蛋白质组水平进行研究, 以30例肝癌易发家系患者、30例无癌家系患者作为研究对象, 采用(SELDI-TOF-MS)及CM10蛋白芯片筛选血清中蛋白质的差异表达, 并找到表达明显改变的标志蛋白, 实验结果发现肝癌易发家系组与无癌家系组在相对分子质量2000-50000范围内共检测到45个蛋白质峰, 其中20个在两组间的比较差异, 有统计学意义(P<0.05), 筛选出的这些有统计学意义的蛋白质峰可能就是我们要寻找的遗传性蛋白质峰. 运用BPS软件筛选出其中的4个蛋白标志物(9645.48、3960.65、7895.66和5916.07 kDa), 建立的血清蛋白质图谱诊断模型, 检测的灵敏度为93%(28/30), 特异性为90%(27/30), 准确率为92%(55/60), 能较好地将两组区分开来, 且经过盲筛将25例肝癌易发家系, 20例肝癌无癌家系组对建立的血清蛋白质图谱诊断模型进行验证, 得到较高灵敏度92%(23/25)与特异性(23/25), 说明模型的合理性和可操作性, 同时这也表明肝癌易发家系组与无癌家系组在血清蛋白组学方面确实存在差异, 原发性肝癌的发生与遗传具有密切相关性. 肝癌易发家系的遗传基因可能在抑癌基因和癌基因上出现失衡或出现遗传易感性[10], 陈圆圆等[11]和肖开银等[12]对广西扶绥县肝癌高发家系遗传基因的相关研究显示谷胱甘肽转硫酶M1(glutathione-S-transferase M1, GSTM1)和谷胱甘肽转硫酶T1(glutathione-S-transferase T1, GSTT1)基因多态性与肝癌家族聚集性相关; GSTM1和GSTT1基因联合缺失与肝癌的发生呈显著正相关, 诸如GST基因多态性、第10号染色体缺失[13]、p53、p21基因表达差异[14]、细胞色素P4501A基因多态性、乙醛脱氢酶2基因多态性[15]等与肝癌之间存在密切相关, 其表达的相关蛋白质就可能异于无癌家系患者, 增加了原发性肝癌发生的危险性.
为了使筛选的遗传性的血清蛋白标志物更具有代表性, 做者将继续收集标本, 扩大样本例数, 验证其准确性, 并做相关性的生物学功能进行鉴定, 为将来建立能够判断肝癌易发家系发生肝癌危险性的预测体系奠定基础.
广西是全国乃至全球肝癌高发区之一, 乙型肝炎病毒感染是广西肝癌高发的主要致病因子, 在相同民族、相同生活环境、生活水平、生活习惯和生活条件下, 存在许多肝癌易发家系, 也有大量无癌家系.
程树群, 副教授, 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院综合治疗三科
蛋白质的差异表达与肝癌发生发展存在着密切关系, 这些易发家系家庭成员遗传的不同基因所表达的不同蛋白质本身可能就具有发生肝癌的危险性.
肖开银等对101例家族聚集性肝癌家族史和临床进行分析分析, 显示肝癌是遗传和环境因素相互作用的结果.
本研究采用SELDI蛋白芯片技术分析广西肝癌高发区肝癌易发家系和无癌家系肝癌发展过程的血清蛋白质组, 并鉴定出蛋白质谱中差异蛋白, 探寻肝癌遗传性相关的蛋白标志.
肝癌发生与家属遗传性有相当的关系, 本研究科学性强. 研究方法正确, 数据可靠, 结论可信, 通过采用表面增强激光解析/电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS) 检测肝癌易发家系患者和无癌家系患者血清蛋白生物标志物, 是目前研究的热点, 从蛋白组学方面寻找肝癌发生相关蛋白对临床和基础研究都起重要作用.
编辑:郭鹏 电编:鲁亚静
| 1. | Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin. 2011;61:69-90. [PubMed] |
| 4. | 李 瑗, 苏 建家, 曹 骥, 欧 超, 仇 效坤, 班 克臣, 杨 春, 覃 柳亮, 罗 丹, 岳 惠芬. 用cDNA阵列技术研究黄曲霉毒素B1诱发树鼩肝癌形成过程中的基因变化. 中华肝脏病杂志. 2003;11:96-99. |
| 9. | 肖 开银, 黎 乐群, 彭 民浩, 梁 水庭, 覃 晓, 陈 希刚, 郭 雅, 覃 忠, 彭 涛, 陈 滨. 家族聚集性肝癌101例家族史和临床分析. 广西医科大学学报. 2005;22:224-226. |
| 12. | 肖 开银, 黎 乐群, 彭 民浩, 覃 晓, 彭 涛, 郭 雅, 陈 滨, 卢 景宁, 秦 权林, 桂 文波. GSTM1、GSTT1基因多态性与家族聚集性肝癌的遗传易感性研究. 中国癌症防治杂志. 2011;3:287-290. |