消癌平与奥沙利铂及恩度联合对人肝癌细胞株SMMC-7721的体外增殖抑制实验

摘要

目的: 通过体外实验研究消癌平(Xiaoaiping, XAP)注射液、奥沙利铂(oxaliplatin, L-OHP)、恩度(Endostar, 重组人血管内皮抑制素)单药及其与XAP的两药及三药联合应用对人肝癌SMMC-7721增殖的影响, 探讨其联合用药的理论依据.

方法: 采用MTT法观察XAP、L-OHP、恩度单药及其XAP的两药及三药联合应用对人肝癌SMMC-7721细胞增殖抑制作用, 并观察细胞形态的变化.

结果: 10-40 μL/mL XAP和1-4 μg/mL L-OHP对SMMC-7721均有明显的抑制作用, 并呈时间和浓度依赖性(P<0.01和P<0.05). 1-12 μg/mL恩度对该细胞无增殖抑制作用. 20 μL/mL XAP和1 μg/mL L-OHP联合对SMMC-7721细胞增殖抑制率分别为82.08%, 优于对照组(P<0.01), 联合具有相加作用. 20 μL/mL XAP与6 μg/mL恩度联合则具有明显的协同作用. 三药联合抑制作用更明显.

结论: XAP、L-OHP单药能抑制肝癌细胞增殖; 恩度无抑制作用; 与XAP两药联合对肝癌细胞增殖有协同增效作用, 三药联合作用更明显.

关键词: 消癌平注射液; 奥沙利铂; 肝癌SMMC-7721细胞株; 增殖抑制

核心提示: 消癌平(Xiaoaiping)注射液、奥沙利铂(oxaliplatin)均证实对肝癌治疗有一定的作用, 且不良反应相对较小, 实验通过上述两药及恩度(Endostar, 重组人血管内皮抑制素)药物联合对肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响观察, 研究药物间联合的依据. 为临床治疗方案的选择提供参考.

Effect of Xiaoaiping, oxaliplatin and Endostar, alone or in combination, on cell proliferation in human hepatoma cell line SMMC-7721

Ji-Heng Ma, Hai-Qing Hua, Ting-Ting Dai, Shu-Kui Qin, Ai-Zhen Yang

Ji-Heng Ma, Department of Oncology, Danyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Danyang 212300, Jiangsu Province, China

Hai-Qing Hua, Shu-Kui Qin, Ai-Zhen Yang, Cancer Center of the Eighty-first Hospital of PLA, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Ting-Ting Dai, Oncology Department, Nanjing General Hospital of Nanjing Military Region, Nanjing 212300, Jiangsu Province, China

Supported by: the Chinese Medicine Clinical Research Program of PLA during the "11^th Five-year" Period, No. 2006051005

Correspondence to: Hai-Qing Hua, Professor, Oncology Department, Cancer Center of the Eighty-first Hospital of PLA, 34-34 Yanggongjing, Nanjing 2100000, Jiangsu Province, China. huahaiqing@csco.org.cn

Received: June 29, 2014
Revised: August 20, 2014
Accepted: September 3, 2014
Published online: October 18, 2014

Abstract

AIM: To assess the effect of Xiaoaiping (XAP), oxaliplatin (L-OHP) and endostatin (Endostar), alone or in combination, on cell proliferation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721.

METHODS: MTT assay was used to assess the effect of XAP, L-OHP and Endostar monotherapy, bitherapy or tritherapy on the proliferation of SMMC-7721 cells. Changes in cell morphology were also observed.

RESULTS: XAP at concentrations of 10-40 μL/mL and L-OHP at 1-4 μg/mL significantly inhibited SMMC-7721 cell proliferation in a time- and concentration-dependent manner (P < 0.01, P < 0.05). Endostar at 1-12 μg/mL had no inhibitory effect on cell proliferation. XAP at 20 μL/mL plus L-OHP at 1 μg/mL inhibited SMMC-7721 cell proliferation by 82.08%, significantly better than that in the control group (P < 0.01), suggesting an additive effect. Endostar at 6 μg/mL combined with 20 μL/mL XAP also had an obvious synergistic effect. Tritherapy resulted in more pronounced inhibition of cell proliferation.

CONCLUSION: XAP or L-OHP monotherapy can inhibit the proliferation of SMMC-7721 cells, while Endostar shows no inhibitory effect. XAP combined with either L-OHP or Endostar has a synergistic effect, and tritherapy has more obvious synergistic effect.

Key Words: Xiaoaiping injection; Oxaliplatin; Hepatoma SMMC-7721 cell line; Proliferation

0 引言

消癌平(Xiaoaiping, XAP)注射液是中药通关藤提取加工而成的中药制剂, 现用于食管癌、胃癌、肺癌、肝癌等多种实体肿瘤的治疗. 奥沙利铂(oxaliplatin, L-OHP)作为新一代的铂类药物证实对肝癌治疗有一定的效果且不良反应较小, 但有效率仍很低. 恩度(Endostar, 重组人血管内皮抑制素)是我国第一个自主研发的血管内皮抑制素, 有抗肿瘤血管生成的作用. 为了进一步研究XAP注射液抗肝癌的作用以及与化疗及抗血管生成药物联合是否存在协同增效作用, 我们以人肝癌SMMC-7721细胞为研究对象, 观察了XAP、L-OHP、恩度单药及其联合对肝癌细胞增殖的影响, 现将结果报告如下.

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌SMMC-7721细胞株: 中国科学院上海细胞生物研究所. XAP注射液(以下简称: XAP): 南京圣和药业有限公司; L-OHP注射液(乐沙定, 以下简称L-OHP): 杭州赛诺菲安特民生制药有限公司; RPMI-1640培养基: Gibco公司; 优级新生小牛血清: 杭州四季青生物工程公司; 胰酶、噻唑蓝(MTT): Sigma公司; 盐酸异丙醇: 0.04 mmol/L: 博士德生物工程有限公司. 超净工作台: 苏州净化设备厂生产; 二氧化碳培养箱: SHEL LAB, 美国; 光学显微镜及照相系统: Olympus, 日本.

1.2 方法

1.2.1 细胞株的培养: 人肝癌SMMC-7721细胞经0.25%的胰酶消化, 洗涤离心后, 用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液传代培养. 每72 h传代1次.

1.2.2 MTT法测定XAP、L-OHP、恩度对人肝癌SMMC-7721增殖的影响: 将含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养的SMMC-7721细胞, 以3×10⁴/mL的密度接种于96孔板内, 100 μL/孔, 并设空白孔和对照孔[1], 37 ℃、50 mL/L CO₂饱和湿度培养箱中培养24 h. XAP组: 加入不同浓度的XAP, 使XAP终浓度分别为10、20、40 μL/mL; L-OHP组: 使L-OHP的终浓度分别为1、2、4 μg/mL; 恩度组的终浓度分别为3、6、12 μg/mL; 空白孔: 加入10%新生牛血清培养液和普通培养液各100 μL; 阴性对照组: 每孔加入100 μL普通培养液, 每个浓度组设3个复孔, 共接种3块培养板. 分别培养24、48和72 h, 每孔加入20 μL MTT(5 mg/L), 培养4 h后, 吸弃上清液, 加入0.04 mmol/L盐酸异丙醇100 μL震荡10 min, 酶标仪570 nm波长, 测各孔吸光度(A)值, 并计算细胞抑制率 = [1-(实验组A值-空白孔A值)/(阴性对照组A值-空白孔A值)]×100%.

1.2.3 MTT法观察XAP联合L-OHP及XAP联合恩度和三药联合对SMMC-7721增殖的影响: 选择XAP(20 μL/mL)与L-OHP(1 μg/mL)和恩度(6 μg/mL)分别进行两药、三药的联合, 实验方法同上. 根据Weeb系数[2]来判定联合应用药物的相互作用, 预估效应C = A×B, 其中A、B分别指两种药物作用后的细胞存活率. 当实际存活率<C时, 联合处理即表现出协同作用; 当C≤实际存活率<A和B时, 两药联合即表现出相加作用.

1.2.4 倒置显微镜下观察各组SMMC-7721细胞形态的变化: 取对数生长期的SMMC-7721细胞0.25%胰酶消化制成单细胞悬液后, 以3×10⁴/mL浓度接种于6孔板中, 每孔加细胞悬液3 mL, 培养24 h后, SMMC-7721各组按终浓度为XAP 20 μL/mL、L-OHP 1 μg/mL、恩度6 μg/mL进行单药和两药三药联合的加药, 阴性对照组加等量的无血清培养液, 于37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度培养箱内继续培养48 h. 在倒置显微镜下观察实验组与对照组细胞形态的变化.

统计学处理 数据统计运用SPSS19.0分析. 其中计数资料采用方差分析, 以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 XAP、L-OHP和恩度单药对SMMC-7721细胞增殖抑制作用

将3种药物单药实验组各组与对照组的抑制率行单因素方差分析, 结果显示10-40 μL/mL XAP和1-4 μg/mL L-OHP与对照组比较, 结果显示对SMMC-7721细胞增殖均有抑制作用, 且具有时间和浓度依赖性, 即随着时间和浓度的增加抑制作用增强(P<0.01, P<0.05). 3-12 μg/mL恩度对SMMC-7721细胞增殖无抑制作用, 并且不存在时间依赖性(P>0.05)(表1, 2).

表1 消癌平与奥沙利铂单药对SMMC-7721细胞增殖的抑制率 (%).

分组	药物浓度	作用时间(h)
	(μL/mL)	24	48	72
消癌平组	10	18.74±9.97	25.83±17.52	44.38±6.13
	20	29.01±7.65	43.78±10.57	76.59±4.15
	40	63.83±12.30	71.72±12.95	86.06±2.08
奥沙利铂组	1	11.33±14.11	50.35±7.97	69.43±4.59
	2	21.32±9.61	58.91±4.63	73.82±4.58
	4	33.53±10.43	63.00±5.20	79.24±5.55
恩度组	3	-10.53±6.15	12.31±14.60	2.03±8.18
	6	-8.47±10.62	5.90±09.79	4.27±4.96
	12	-2.77±11.80	9.21±11.04	-4.20±2.63

表2 SMMC-7721细胞单药和联合组增殖抑制率 (%).

分组	作用时间(h)
	241	48	72
消癌平组(20 μL/mL	29.01±7.65	43.78±10.57	76.59±4.15
奥沙利铂组(1 μg/mL)	11.33±14.11	50.35±7.97	69.43±4.59
恩度(6 μg/mL)	-8.47±10.62	5.90±09.79	4.27±4.96
消癌平+奥沙利铂组	30.26±12.71	53.94±13.05ac	82.08±5.68bc
消癌平+恩度组	41.62±12.58	63.86±12.18ac	87.13±3.22ad
三药联合组	28.40±12.73	65.04±20.71aceg	88.13±1.10aceg

¹对照组24 h因作用时间较短未行比较.

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 消癌平组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 奥沙利铂组;

^eP<0.05 vs 消癌平+奥沙利铂组;

^gP<0.05 vs 消癌平+恩度组.

2.2 XAP与L-OHP和恩度两药及三药联合对SMMC-7721细胞增殖抑制作用

在单药实验组的基础上选择20 μL/mL XAP和1 μg/mL L-OHP及联合及20 μL/mL XAP联合6 μL/mL恩度实验观察对SMMC-7721细胞增殖的影响, 结果在不同时间段的抑制作用联合组优于单药组(P<0.05). 根据Web系数判定两药联合的效应结果: XAP与L-OHP联合在不同时间段药物联合效应基本呈相加作用, XAP联合恩度则表现为协同作用. 三药组抑制作用更明显(表2, 3).

表3 联合效应判定结果.

联合组分组	联合效应(Weeb系数判定)(h)
	24	48	72
消癌平+奥沙利铂	相加	相加	相加
消癌平+恩度	协同	协同	协同

2.3 XAP和L-OHP对SMMC-7721细胞形态的影响

对照组: SMMC-7721细胞大小均一, 呈上皮型贴壁生长, 外形为圆形或多角形, 轮廓清晰, 细胞间结构紧密, 胞浆均匀透明, 折光性好, 生长旺盛. 实验组: XAP组的细胞, 体积变小, 逐渐变圆, 细胞间接触变松, 折光性及贴壁能力变弱, 细胞内颗粒增多; L-OHP组的细胞变长, 甚至呈拉丝状, 细胞间接触变松, 透光度增加; 联合组的细胞数目明显减少, 细胞形态轮廓呈细长型, 细胞颗粒增多, 并伴有细胞碎片(图1).

图1 对照组和药物组作用后的变化情况(×400). A: 对照组; B: 20 μL/mL消癌平组; C: 1 μg/mL L-OHP组; D: 消癌平联合L-OHP组; E: 消癌平联合恩度组; F: 三药组. L-OHP: 奥沙利铂.

3 讨论

在我国, 肝癌占全球总人数的55%, 是我国最常见的肿瘤之一, 占全国肿瘤相关死亡的第3位[3], 其主要致病因素包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染及长期饮酒、黄曲霉素等. 肝癌治疗的最有效手段为手术切除[4], 然而大多数的肝癌发现时已属中晚期, 失去了手术指征. 晚期肝癌主要以介入(肝动脉化疗栓塞术、射频消融、氩氦刀等)治疗联合内科治疗, 以化疗及分子靶向治疗为晚期肝癌的综合治疗, 整体生存期仍然较低. 因此需要寻求一种更有效的内科联合治疗手段.

XAP注射液系由摩罗科牛奶菜属植物通关藤的根、茎或叶经现代工艺所制成的中药制剂, 研究表明, 本品对多种实体肿瘤有治疗作用, 如: 食管癌、肺癌、胃癌、大肠癌、宫颈癌、肝癌等[5]. 多项研究证XAP注射液对卵巢癌细胞Cao-3、人膀胱癌细胞、人红白血病HEL细胞、胃癌SGC-7901细胞、小鼠Hepal-6细胞等均有不同程度的抑制作用[6-10]. 但人肝癌细胞方面缺乏具体的实验研究, 尤其是联合化疗、抗血管生成治疗时缺乏有效的根据. L-OHP是第3代铂类药物, EACH研究(亚洲范围开放性、多中心、随机的国际晚期肝癌Ⅲ期临床研究), 首次证实了FOLFOX4化疗治疗晚期肝癌中获得阳性结果. L-OHP作为新一代的化疗药物取得了治疗上更好的客观缓解率(objective response rate, ORR)、无进展生存期(progression free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS)[11]. 武燕等[12]、张海鹏等[13]证实L-OHP对人肝癌株BEL-7402、SMMC-7721肝癌细胞株抑制增殖和促进其凋亡的作用. 重组人血管内皮抑制素(恩度)能够抑制肿瘤血管生成阻断肿瘤的营养供给, 控制肿瘤的生长, 但其本身有无抑制肿瘤的作用尚存在争议[14,15]. 杜凯[16]报道恩度与含第3代铂类药物联合治疗晚期非小细胞肺癌, 可以提高治疗有效率及患者的生存期达20%. 因此选用上述药物与XAP的不同组合观察对人肝癌细胞SMMC-7721抑制率, 为临床肝癌治疗选择药物联合和今后的进一步研究提供实验基础.

本研究结果表明, 体外10-40 μL/mL XAP和1-4 μg/mL L-OHP单药对人肝癌SMMC-7721细胞增殖有抑制作用, 并且具有时间和浓度的依赖性, 即随着作用时间的延长和浓度的增加抑制作用逐渐增强. 单用恩度抗血管生成对人肝癌SMMC-7721细胞增殖无影响. 采用20 μL/mL XAP与1 μg/mL L-OHP和6 μg/mL恩度两药联合应用对其抑制具有相加和协同效应. 三药联合效果更好. 因此可以为临床对肝癌治疗联合用药提供理论依据. 抗血管生成药物恩度需要与化疗药或中药抗肿瘤制剂联合使用. 而其具体作用机制可能与抑制肝癌细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成等相关, 今后还需要开展进一步的相关性实验研究证实.

评论

背景资料

在我国肝癌占全球总人数的55%, 是我国最常见的肿瘤之一, 占全国肿瘤相关死亡的第3位, 特点: 肝癌发现时已属中晚期, 合并肝炎病毒感染, 多数无法手术. 现今虽然有索拉菲尼和舒尼替尼等分子靶向药物的问世内科治疗的手段仍匮乏,生存期短, 整体有效率仍然较低. 因此需要寻求一种更有效的内科联合治疗手段.

同行评议者

代智, 副研究员, 复旦大学附属中山医院肝癌研究所; 杨家和, 教授, 中国人民解放军第二军医大学附属东方肝胆外科医院综合治疗三科

研发前沿

抗血管生成药物是当今治疗的主要发展方向之一, 但如何选择药物的联合使用是问题的关键所在, 现需要寻找一种或多种低度高效的药物间的联合治疗, 并在不影响患者生活质量的前提下, 提高晚期肝癌的客观缓解率(objective response rate, ORR)、无进展生存期(progression free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS).

相关报道

EACH研究(亚洲范围开放性、多中心、随机的国际晚期肝癌Ⅲ期临床研究), 首次证实了FOLFOX4化疗治疗晚期肝癌中获得阳性结果. 奥沙利铂(oxaliplatin, L-OHP)作为新一代的化疗药物取得了治疗上更好的ORR、PFS和OS. 且不良反应相对较小, 因此选择该药进行联合.

创新盘点

中药注射剂消癌平(Xiaoaiping, XAP)与化疗药物L-OHP及抗血管生成药物恩度联合治疗肝癌, 同类研究极少, 具有广阔的前景.

应用要点

XAP与L-OHP和恩度两药联合应用对肝癌SMMC-7721细胞抑制有相加和协同效应, 三药联合效果更好. 为临床肝癌治疗提供一个药物组合的选择, 体外实验具有较好的阳性结果.

同行评价

该研究选题很好, 对肝癌患者的治疗可提供一定的参考价值.

备注

编辑:郭鹏 电编:都珍珍

参考文献

1.	Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55-63.  [PubMed]  [DOI]

2.	Jandial DD, Farshchi-Heydari S, Larson CA, Elliott GI, Wrasidlo WJ, Howell SB. Enhanced delivery of cisplatin to intraperitoneal ovarian carcinomas mediated by the effects of bortezomib on the human copper transporter 1. Clin Cancer Res. 2009;15:553-560.  [PubMed]  [DOI]

3.	Livraghi T, Mäkisalo H, Line PD. Treatment options in hepatocellular carcinoma today. Scand J Surg. 2011;100:22-29.  [PubMed]  [DOI]

4.	Shingyoji M, Ando S, Nishimura H, Nakajima T, Ishikawa A, Itakura M, Iizasa T, Kimura H. VEGF in patients with non-small cell lung cancer during combination chemotherapy of carboplatin and paclitaxel. Anticancer Res. 2009;29:2635-2639.  [PubMed]  [DOI]

5.	石 涛. 消癌平注射液临床应用1009例分析. 江苏医药. 2012;9:1109-1111.  [PubMed]  [DOI]

6.	葛 惠心, 畅 继武. 消癌平对人膀胱癌细胞体外生长作用的实验研究. 临床合理用药. 2012;5:86-87.  [PubMed]  [DOI]

7.	王 淳, 董 秀, 王 梅, 王 晓波. 消癌平注射液下调MMP-9基因表达抑制卵巢癌细胞Cao-3迁移机制的研究. 中国肿瘤临床. 2012;39:886-888.  [PubMed]  [DOI]

8.	Koumtebarye E, Su N, Hu WF, Lin SS, Sun L, Yuan ST. Antitumor activity of Xiaoaiping injection on human gastric cancer SGC-7901 cells. CJNM. 2012;10:339-346.  [PubMed]  [DOI]

9.	李 伟杰, 蔺 春芳, 任 元满, 王 维. 消癌平抗肝癌细胞体外生长的实验研究. 中国药物与临床. 2010;10:164-165.  [PubMed]  [DOI]

10.	方 奕奇, 孙 雪梅. 消癌平注射液体外作用于HEL细胞株的实验研究. 医学信息: 中旬刊. 2010;2:1538.  [PubMed]  [DOI]

11.

Qin S, Bai Y, Lim HY, Thongprasert S, Chao Y, Fan J, Yang TS, Bhudhisawasdi V, Kang WK, Zhou Y. Randomized, multicenter, open-label study of oxaliplatin plus fluorouracil/leucovorin versus doxorubicin as palliative chemotherapy in patients with advanced hepatocellular carcinoma from Asia. J Clin Oncol. 2013;31:3501-3508.  [PubMed]  [DOI]

12.	武 燕, 张 阳, 吴 涛. 索拉菲尼联合奥沙利铂对肝癌BEL-7402细胞抑制作用的实验研究. 放射介入学杂志. 2011;9:780-783.  [PubMed]  [DOI]

13.	张 海鹏, 杨 家梅, 张 嵩, 曲 艳红, 张 蕾. 全反式维甲酸联合奥沙利铂对人SMMC-7721肝癌细胞株的作用. 世界华人消化杂志. 2012;20:851-855.  [PubMed]  [DOI]

14.	Ling Y, Yang Y, Lu N, You QD, Wang S, Gao Y, Chen Y, Guo QL. Endostar, a novel recombinant human endostatin, exerts antiangiogenic effect via blocking VEGF-induced tyrosine phosphorylation of KDR/Flk-1 of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007;361:79-84.  [PubMed]  [DOI]

15.	游 振宇, 王 金万. 重组人血管内皮抑制素对肺鳞癌细胞抑制作用的体外实验. 肿瘤防治研究. 2009;36:5-8.  [PubMed]  [DOI]

16.	杜 凯. 恩度联合第3代含铂方案治疗晚期肺细胞肺癌的疗效观察. 当代医学. 2013;19:34-35.  [PubMed]  [DOI]