HBx蛋白与细胞膜钙离子通道蛋白Orai1的关系

摘要

目的: 研究乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virus x gene, HBx)蛋白调节细胞内钙离子可能分子机制, 揭示乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)诱导肝癌的可能途径.

方法: 培养HEK293细胞, 取第2代HEK293细胞转染pcDNA-HBx质粒, 培养12、24和48 h后, 细胞活力细胞毒性检测(cell counting kit-8, CCK-8)观察转染后细胞生长情况, Western blot检测HBx蛋白的表达情况, 当共同转染HBx基因、Orai1基因或STIM1基因后co-IP实验、免疫荧光检测观察细胞内蛋白结合情况.

结果: 转染pcDNA-HBx质粒后HBx蛋白可以在HEK293细胞高表达, 转染后的24 h后细胞增殖加快(P<0.05), co-IP实验及免疫荧光检测结果均显示, HBx蛋白在细胞内可以与Orai1蛋白结合.

结论: HBx蛋白通过与细胞膜钙离子通道Orai1结合, 来升高细胞内钙离子浓度, 从而影响细胞增殖等活性.

关键词: 乙型肝炎病毒x蛋白; Orai1蛋白; 乙型肝炎病毒; 钙离子; 肝癌

核心提示: 本研究首次发现在细胞内乙肝病毒x基因(hepatitis B virus x gene, HBx)蛋白可以与SOCs在细胞膜上的孔蛋白Orai1蛋白相互作用, 这可能是HBx蛋白通过内质网途径调节细胞内钙离子平衡的重要途径, 从而影响细胞生物活性, 加速肝细胞恶性转变.

Hepatitis B virus X protein disturbs intracellular calcium signaling by binding to Orai1 protein

Jun Wang, Sheng-Song He, Ya-Nan Liu, Pan Zhang, Jing-Hong Yao

Jun Wang, Sheng-Song He, Ya-Nan Liu, Pan Zhang, Jing-Hong Yao, Department of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Supported by: National Nature Science Foundation of China, No. 81001063.

Correspondence to: Sheng-Song He, Professor, Department of Infectious Diseases, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, 1277 Jiefang Road, Wuhan 430022, Hubei Province, China. shengshexiehe@sina.cn

Received: September 28, 2013
Revised: October 28, 2013
Accepted: November 19, 2013
Published online: January 8, 2014

Abstract

AIM: To determine whether HBx protein elevates the intracellular calcium through interacting with SOC components (STIM1 and Orai1).

METHODS: The pcDNA-Flag-HBx plasmid was transfected into HEK293 cells, and viability of transfected cells was determined by cell counting Kit-8 (CCK8). The interaction between SOC components and HBx protein was confirmed in co-immunoprecipitation (Co-IP) and immunofluorescence assays. Subsequent confocal microscopic analysis revealed that HBx protein also co-localizes with full-length STIM1 and Orai1 complexes in HEK293 cells following Ca2+ store depletion.

RESULTS: The results indicated that HBx protein interacts with the Orai1 in binding assays and this interaction may be modulated by the intracellular Ca²⁺ concentration.

CONCLUSION: HBx protein binds to STIM1-Orai1 complexes to positively regulate the activity of SOCs.

Key Words: HBx protein; Hepatitis B virus; Orai1; Intracellular Ca²⁺; Hepatocellular carcinoma

0 引言

在我国乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的最主要致病原因, 绝大部分HCC患者合并有HBV感染[1]. HBV促进肝细胞恶变及侵袭、转移, HBV可以通过内质网应激, 增加细胞对缺氧耐受从而促进肿瘤细胞生长, 还可以通过干预细胞内钙离子平衡从而影响细胞生长, 参与肝癌的形成, 但是其具体作用机制尚不明确[2-4]. 乙肝病毒x基因(hepatitis B virus x gene, HBx)编码的HBx蛋白具有强大的恶性转化能力, 与肝细胞肝癌发生关系密切[5]. HBx蛋白是一种多功能蛋白, 可以调节细胞转录、蛋白降解、细胞胞浆钙离子信号、细胞周期及细胞的凋亡途径[4,6]. 钙离子是重要的细胞内第二信使, 参与细胞的多种生理病理过程[7]. 已有研究表明, 经通透性钙池调节离子通道SOCs进入细胞的钙离子对肝细胞系Huh-7和HepG2细胞的增殖发挥重要作用[8]. 我们发现, HBx在促进HBV复制及肝细胞增殖恶性转化过程中, 常首先激活钙离子信号, 引起细胞内钙离子浓度失稳, 但是HBx蛋白是如何调节细胞内钙离子机制目前还不清楚, 本研究从内质网途径入手研究HBx蛋白调节细胞内钙离子可能分子机制.

1 材料和方法

1.1 材料

HEK293(ATCC, Manassas, USA); BL21(DE3)菌株、携带HBx全长基因的pcDNA-Flag-HBx质粒及pcDNA-GFP-HBx质粒、携带Orai1全长基因的pcDNA-HA-Orai1质粒、携带 基质交互作用蛋白1(stromal interaction molecule-1, STIM1)全长基因的pcDNA-HA-STIM1质粒(从NIH神经实验室Prof. Lutz Birnbaumer处获得); 细胞培养基DMEM、6孔培养板、胎牛血清(Gibco公司); PBS(武汉博士德公司); 蛋白质marker(晶美生物有限公司); 胰蛋白酶、鼠单克隆HA抗体、羊抗鼠多克隆抗体、flag-beeds、HA-beeds、CY3标记的HA IgG(Sigma公司); ECL显色试剂盒(默克公司); 细胞活力细胞毒性检测(cell counting kit-8, CCK-8)试剂盒(碧云天生物技术研究所); Lipofectamine 2000(Invitrogen); 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS); 激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: HEK293细胞使用10%胎牛血清的DMEM培养基培养, 待细胞贴壁生长达80%-90%融合度时, 细胞生长状态良好, 预热的PBS洗细胞, 弃去PBS; 用预热的胰蛋白酶消化细胞, 细胞脱落后, 加入含10%FBS培养液终止消化反应, 并将细胞悬液转入离心管中; 1000 r/min, 离心5 min, 去除上清; 加入10 mL DMEM培养液(含10%FBS), 重新悬浮细胞, 进行细胞计数, 将适当数量的细胞悬液转至6孔培养板中(细胞密度6×10⁴个/mL); 置于37 ℃ 5%CO₂的培养箱中培养.

1.2.2 细胞转染: 在Lipofectamine 2000介导下, 将pcDNA-Flag-HBx、pcDNA-HA-Orai1、pcDNA-HA-STIM1及空载质粒转染或共转染HEK293细胞. 分别将需要共转染质粒各2.5 g装入250 L不含血清的DMEM培养基的1.5 mL Ep管中混匀. 将10 L Lipofectamine 2000装入500 L不含血清的DMEM培养基的1.5 mL Ep管中混匀, 将含2.5 g质粒的无血清培养基分别和含有5 L Lipofectamine 2000的无血清培养基250 L混合, 轻轻混匀, 室温静置30 min. 将含有DNA和脂质体的液体小心加入换液后的每个培养孔中, 分散均匀, 置于37 ℃ 5%CO₂的培养箱孵育5 h后去除含脂质体复合物的培养基, 加入2 mL含10%血清的DMEM培养基, 置于37 ℃ 5%CO₂的培养箱中培养48 h.

1.2.3 细胞活性检测: CCK8检测转染后细胞增殖情况: 将转染后的第2代细胞接种到96孔板, 密度为2.5×10³个/孔, 每孔设置4个复孔. 每孔加入100 L细胞悬液, 后加入含胎牛血清10%培养液150 L. 置于37.0 ℃、5%CO₂浓度和饱和湿度的培养箱中培养, 每24 h换液1次, 实验组为转染细胞组, 对照组(control)未转染细胞组. 分别在0、12、24、48 h, 每个时间点取出96孔板, 实验组对照组每次取6个孔, 加入细胞毒性/增殖检测试剂CCK-8 10 L, 避光放入37.0 ℃培养箱中培养2 h, 取出用酶标仪测吸光度值, 激发光波长为450 nm. 每个时间点取出96孔板, 加入20 L的CCK8试剂, 避光, 37 ℃孵育2 h, 后使用分光光度计450 nm检测吸光光度值, 根据吸光光度值确定存活的细胞个数, 并与对照组细胞增殖情况进行

对比.

1.2.4 Western blot检测HBx蛋白的表达: 转染48 h后, 吸走培养孔中培养基, 用PBS洗涤2次, 加入预冷的细胞裂解液(含cocktail蛋白酶抑制剂)1 mL, 细胞刮收集细胞; 超声裂解细胞; 4 ℃, 8000 r/min, 离心15 min, 取上清, 水浴65 ℃ 5 min, 蛋白变性. 取适量表达蛋白样品上样后, 用12% SDS-PAGE电泳分离, 然后转印于PVDF膜上, 用含5%的脱脂奶粉TBST室温封闭蛋白印迹膜l h, 加入一抗即鼠单克隆myc抗体, 4 ℃孵育过夜, 用TBST振摇洗涤3次, 10 min/次, 加入二抗即羊抗鼠IgG, 室温孵育2 h, 接着用TBST振摇洗涤3次, 10 min/次, 用ECL显色, 暗室胶片曝光显影.

1.2.5 免疫共沉淀: 转染48 h后收集细胞, 提取目的蛋白(具体操作同上). 取30 L含有flag蛋白的琼脂糖珠(flag-beeds)或HA蛋白的琼脂糖珠(HA-beeds), 用预冷的RIPA buffer洗3遍, 12000 r/min,离心1 min, 并用RIPA buffer配制成1:1琼脂糖珠悬浮液. 将琼脂糖珠悬浮液加入到已收集的细胞裂解液中, 4 ℃层析柜旋转孵育4 h. 在4 ℃, 以12000 r/min, 离心3 min; 将上清小心吸去, 琼脂糖珠悬浮液用预冷的RIPA buffer洗3遍, 800 L/遍; 最后加入35 L 2×SDS上样缓冲液, 将上样样品水浴95 ℃ 5 min, 蛋白变性. 取适量表达蛋白样品上样后, 用10%的SDS-PAGE电泳分离, 然后转印于PVDF膜上, 用含5%的脱脂奶粉TBST室温封闭蛋白印迹膜l h, 加入一抗即鼠单克隆HA抗体或flag抗体, 4 ℃孵育过夜. 用TBST振摇洗涤3次, 10 min/次, 加入二抗即羊抗鼠IgG, 室温孵育2 h, 接着用TBST振摇洗涤3次, 10 min/次, 用ECL显色, 暗室胶片曝光显影.

1.2.6 免疫荧光检测HBx蛋白在细胞内与Orai1蛋白结合: 取6孔板, 将其分为3组, 每组2孔. 每孔先放入细胞爬片, 用0.1 mg/mL多聚赖氨酸包被各孔. 3组每孔均接种HEK293细胞悬液2 mL(细胞密度6×10⁴个/mL), 置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱培养, 待细胞贴壁生长达80%时, 分别用pcDNA-GFP-HBx、pcDNA-HA-Orai、pcDNA-GFP-EV质粒共转染HepG2细胞. 转染48 h后, 吸走培养基, 用PBS轻柔的洗涤1次, 将细胞爬片用4%多聚甲醛固定15 min; 室温下, 用PBS洗涤3次, 10 min/次; 加入0.1%Triton X-100破膜3 min; 再次用PBS洗涤3次, 10 min/次; 用10%牛血清(BSA)封闭30 min, 300 L/孔; 吸出多余封闭血清, 用PBS轻柔的洗涤1遍, 加入由PBS稀释的CY3标记的HA IgG(1:100), 100 L/孔, 室温避光孵育12 h; 用PBS洗涤3次, 10 min/次; 取出细胞爬片甘油封片后于激光共聚焦显微镜下观察, 并拍照保存, 红色荧光为Orai1蛋白表达, 绿色荧光为HBx蛋白表达, 黄色荧光为细胞内HBx蛋白与Orai1蛋白的结合.

统计学处理 采用SPSS12统计软件处理数据, 测定结果均以mean±SD表示, 两组数据间使用配对t检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 细胞培养与转染

培养HEK293细胞, 采用脂质体Lipofectamine 2000方法转染细胞, 24 h用显微镜观察细胞生长情况, 观察结果显示转染后的细胞生长良好(图1).

图1 转染24 h后HEK293细胞生长情况.

2.2 细胞活性检测

使用pcDNA-HBx质粒转染HEK293细胞后, 使用CCK8试剂观察细胞的活性, 结果显示24、48 h, 实验组与对照组相比吸光度值均明显增高(P<0.05), 显示转染pcDNA-HBx质粒后HEK293细胞增殖明显加快(图2).

图2 转染后HEK293细胞活性检测.

2.3 HBx蛋白表达

pcDNA-HBx或者pcDNA质粒转染HEK293细胞24 h后, 并且HBx蛋白使用myc标记, 收集HEK293细胞通过Western blot检测结果显示细胞内可以表达HBx蛋白, 对照组无表达(图3).

图3 HBx蛋白在HEK293中表达. 1: 转染myc-EV; 2: 转染myc-HBx.

2.4 体内检测免疫共沉淀

为检测HBx蛋白如何通过内质网调节细胞内钙离子, 收集HEK293细胞蛋白, 进行co-IP实验, 验证Orai1或者STIM1蛋白是否可以HBx蛋白结合, co-IP实验结果示, 共转染HA标记的Orai1基因, HA标记的STIM1基因及Flag标记的HBx基因到HEK293细胞, 使用co-IP技术HA标记的Orai1蛋白可以与Flag标记的HBx蛋白免疫共沉淀(图4), 表明Orai1-HBx在HEK293细胞内可以发生聚合, Orai1蛋白可以直接与HBx蛋白结合. 而对照组HA标记的STIM蛋白不与HBx蛋白发生免疫共沉淀, 因此结果显示在细胞内HBx蛋白可以与Orai1蛋白形成异二聚体, 从而影响细胞内钙离子的平衡.

图4 co-IP实验验证Orai 1蛋白与HBx蛋白相互作用情况. 1: Flag-HBx+HA-EV; 2: Flag-EV+HA-orail; 3: Flag-HBx+HA-orail; 4: Flag-HBx+HA-STIM1; 5: Flag-EV+HA-STIM1.

2.5 免疫荧光检测HBx蛋白在细胞内与Orai1蛋白结合

pcDNA-GFP-HBx或者pcDNA-HA-Orai1质粒转染HEK293细胞后, 48 h后收集细胞进行免疫荧光染色, 后通过激光共聚焦显微镜观察细胞(图5), 结果显示: GFP标记的HBx蛋白主要在细胞浆表达, 细胞核也有少量表达, 为绿色, HA-Orai1蛋白使用cy3标记的二抗, 主要在细胞膜表达, 为红色, 阳性细胞即细胞内HBx基因表达蛋白与细胞内的Orai1蛋白结合的细胞细胞内为黄色, 阴性细胞为红色或绿色(即二者蛋白无结合). 用过激光共聚焦软件分析显示阳性细胞数为46个, 对照组细胞内无相关蛋白表达.

图5 激光共聚焦显微镜检测HBx蛋白与Orai1蛋白在HEK293细胞内表达情况(×400). A: HBx蛋白在细胞内表达; B: HBx蛋白与Orai1蛋白在细胞内相互结合; C: Orai1蛋白在细胞内表达.

3 讨论

HBV复制与肝癌的发生密切相关, Hbx蛋白是HBV的核心蛋白, 他是一种多功能蛋白, 可以调节细胞转录、蛋白降解、细胞浆钙离子信号、细胞周期及细胞的凋亡途径, 其中调节细胞浆钙离子信号、蛋白酶体的活性等与HBV复制及肝细胞增殖密切相关, 但是HBx蛋白是如何干预细胞内钙离子平衡来调节细胞增殖从而影响HBV复制, 具体机制不清.

目前研究显示HBx蛋白可以增加细胞内钙离子及促进细胞增殖[9,10], 而且HBx蛋白通过线粒体途径干扰细胞内钙离子平衡已有报道[11], 但是内质网做为细胞钙离子储存库, 可以调节及维持细胞内钙离子平衡[12]. 为明确HBx蛋白经如何通过内质网相关途径调节细胞内钙离子平衡的, 本课题组从内质网钙离子调节关键蛋白Orai1及STIM1入手, 探讨HBx蛋白调节细胞内钙离子平衡机制. Orail蛋白是钙离子释放激活的钙离子通道(CRAC通道)重要的亚单位, 对存储调控性钙离子内流(store-operated calcium entry, SOCE)起着关键性作用[13]. STIM1为内质网Ca²⁺浓度感受器, Orail是SOCs在细胞膜上的孔蛋白, 同时发现Orail与STIM1的联合作用可以大大提高SOCE和CRAC通道的活性[14,15]. Oh等[16]研究表明, HBx能升高细胞内钙离子浓度, 激活细胞信号通道, 促进细胞增殖. 我们研究发现, Western blot检测转染后细胞内HBx蛋白的表达情况, 结果显示转染后的HEK293细胞可以表达HBx蛋白. co-IP实验证实在细胞内HBx蛋白可以与Orai1蛋白形成异二聚体, 该结果显示在细胞内HBx蛋白可以与SOCs在细胞膜上的孔蛋白Orai1蛋白相互作用. 因此HBx蛋白与Orai1蛋白结合可能是HBx蛋白通过内质网途径调节细胞内钙离子平衡的重要途径, 从而影响细胞生物活性. 免疫荧光检测再次证明在细胞内HBx蛋白可以与Orai1蛋白结合, 从而影响细胞内钙离子平衡. 此实验结果与之前研究HBx蛋白通过线粒体途径调节细胞内钙离子平衡有所不同, Gearhart等[11]研究发现HBx蛋白可以通过线粒体途径调节细胞内钙离子平衡, 影响细胞的生理活性. CCK8检测显示HEK293细胞转染HBx质粒后, 细胞增殖加速, 此结果可能与HBx蛋白与Orai1蛋白相互作用, 升高细胞内钙离子, 加快细胞增殖有关. 其中转染后12 h, 细胞数较对照组减少, 可能与转染时加入Lipofectamine 2000有关. 此结果与Yang等[17]研究相似, 与HBV感染后可能导致癌症形成有关.

本研究从内质网着手研究HBx蛋白调节细胞内钙离子的具体分子途径, 首次提出HBx蛋白可以与Orai1蛋白结合干预细胞内钙离子平衡, 从而调节细胞增殖等生物活性, 可能与癌症形成有关, 但是HBx蛋白与Orai1蛋白结合的具体部位, 及二者结合后对细胞内钙离子平衡的影响等目前还不清楚, 还需继续研究.

评论

背景资料

在我国乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是肝细胞癌的最主要致病原因, 近年来发现HBV的x基因编码蛋白即乙型肝炎病毒x基因(hepatitis B virus x gene, HBx)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生和发展过程中发挥重要的作用. 钙离子是重要的细胞内第二信使, 参与细胞的多种生理病理过程. 本研究从内质网途径入手研究HBx蛋白调节细胞内钙离子可能分子机制.

同行评议者

傅晓辉, 副教授, 副主任医师, 东方肝胆外科医院

研发前沿

已有实验研究发现HBx在促进HBV复制及肝细胞增殖恶性转化过程中, 常首先激活钙离子信号, 引起细胞内钙离子浓度失稳, 但是HBx蛋白是如何调节细胞内钙离子机制目前还不清楚, 需进一步研究.

相关报道

目前研究表明HBx蛋白可以增加细胞内钙离子内流及促进细胞增殖, 而且HBx蛋白通过线粒体途径干扰细胞内钙离子平衡已经有报道.

创新盘点

做为细胞钙离子储存库的内质网, 在调节及维持细胞内钙离子平衡方面起着重要作用. 但HBx蛋白如何通过内质网相关途径调节细胞内钙离子平衡却鲜有报道, 本课题组从内质网钙离子调节关键蛋白Orai1及STIM1入手, 探讨HBx蛋白调节细胞内钙离子平衡机制.

应用要点

本研究从内质网着手研究HBx蛋白调节细胞内钙离子的具体分子途径, 揭示HBV诱导HCC的可能途径, 为肝癌研究提供新的研究方向.

同行评价

本文首次提出HBx蛋白可以与Orai1蛋白结合干预细胞内钙离子平衡, 从而影响细胞增殖等生物活性, 提示了乙型肝炎病毒与肝癌发生之间新的关系.

备注

编辑:田滢 电编:鲁亚静

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