腺病毒介导的KDR-CDglyTK系统在治疗胃癌中的旁观者效应机制

摘要

目的: 探讨重组腺病毒介导KDR-CDglyTK系统杀伤胃癌SCG7901细胞时细胞缝隙连接与旁观者效应的关系.

方法: 感染复数(multiplicity of infection, MOI) = 100时, 将携带融合基因重组腺病毒体外感染SCG7901、HeLa细胞, 检测细胞的感染效率以及转基因肿瘤细胞在mRNA水平上融合基因的表达; 用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)检测SCG7901、HeLa细胞以及芹黄素作用上述两种细胞的细胞间通讯功能. 将已转染细胞和未转染细胞分别按10%:90%和5%:95%两种比例混合, 用含或不含芹黄素的培养基, 培养24 h后, 在不同组中分别加入GCV、5-FC两者的混合液, 72 h后用MTT法检测细胞存活率.

结果: 受感染的SCG7901和HeLa细胞中均有绿色荧光蛋白的表达. 图像中观察到在芹黄素作用下SCG7901细胞淬灭后荧光强度明显降低, 随后随着时间的推移, 被淬灭细胞的荧光强度逐渐恢复, 在相同时间内其恢复强度较未应用上调剂的SCG7901细胞要强; 而在芹黄素作用下的HeLa细胞被淬灭后荧光强度明显降低, 随时间的推移荧光强度无明显恢复, 在上调剂芹黄素作用下的SCG7901与HeLa细胞间的荧光恢复率有差异. 同时, 观察到双自杀基因系统在转基因细胞比例分别占5%、10%时, SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组间细胞生存率有差异(F = 144.42, P = 0.000)、(F = 407.83, P = 0.000), 而HeLa细胞在各组间的细胞生存率无统计学意义(F = 0.386, P = 0.765)、(F = 0.895, P = 0.472).

结论: FRAP技术证实SCG7901细胞间通讯功能与缝隙连接有一定关系, 而HeLa细胞不存在细胞间通讯功能. 双自杀基因系统治疗SCG7901细胞时存在旁观者效应而且上调剂可以扩大其旁杀效应; 但HeLa细胞不存在旁观者效应. 双自杀基因系统治疗胃癌细胞时旁观者效应与细胞间缝隙连接有关.

关键词: 胃癌; 荧光漂白恢复技术; 缝隙连接; 旁观者效应; 自杀基因

Mechanism of bystander effect in therapy of stomach cancer with the KDR-CDglyTK suicide gene system

Qiang Li, Zong-Hai Huang, Fei Chen, Jin-Long Yu

Qiang Li, Zong-Hai Huang, Fei Chen, Jin-Long Yu, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China

Correspondence to: Qiang Li, Associate Chief Physician, Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China. lq642@hotmail.com

Received: December 30, 2011
Revised: February 3, 2012
Accepted: February 27, 2012
Published online: March 28, 2012

Abstract

AIM: To study the relation between intercellular gap connection and bystander effect in therapy of stomach cancer with the KDR-CDglyTK suicide system.

METHODS: SCG7901 and HeLa cells were infected with adenovirus-based KDR-CDglyTK system (AdKDR-CDglyTK), and the expression of CDglyTK fusion gene in infected cells was confirmed by RT-PCR. Gap junction intercellular communication was determined by fluorescence recovery after photobleaching (FRAC) in SCG7901 and HeLa cells in the presence or absence of versulin. Infected and non-infected cells were mixed with a proportion of 5% and 95% or 10% and 90%, cultured in the presence or absence of versulin, and then used to detect cell survival by MTT assay.

RESULTS: The expression of GFP was observed in both infected SCG7901 cells and HeLa cells. Fluorescence intensity was gradually recovered at different time points after bleaching in SCG7901 cells cultured with versulin. Compared to SCG7901 cells cultured without versulin, the fluorescence recovery of bleached cells cultured with versulin was more obvious at the same time points. In contrast, fluorescence intensity showed no significant changes in HeLa cells cultured with versulin. The mean fluorescence recovery rate had a significant difference between SCG7901 and HeLa cells cultured with versulin. When infected and non-infected cells were mixed at different proportions, cell survival showed a significant difference between groups of SCG7901 cells (F = 144.42, 407.83; both P = 0.000), but had no significance difference between groups of HeLa cells (F = 0.386, 0.895; P = 0.765, 0.472).

CONCLUSION: There is a relation between intercellular communication and gap connection in SCG7901 cells but not in HeLa cells. Versulin can enhance the bystander effect in therapy with the suicide gene system in vitro. The mechanism of bystander effect in therapy with the suicide gene system may involve gap connection.

Key Words: Stomach cancer; Fluorescence recovery after photobleaching; Gap connection; Bystander effect; Suicide gene

0 引言

胃癌是最常见的消化系恶性肿瘤, 进展期胃癌的常规治疗效果往往不尽如人意, 因此人们开始关注胃癌的基因治疗. 在基因治疗诸多方法中, 自杀基因疗法是目前认为最具临床应用潜力的肿瘤基因治疗策略之一[1,2]. 体内外实验表明旁观者效应是自杀基因的独特作用, 即不仅转导了自杀基因的细胞可以在给予前药后被杀死, 而且与其相邻的未转导自杀基因的细胞亦可被杀死. 旁观者效应扩大了自杀基因的杀伤效果, 在自杀基因疗法中起着相当重要的作用, 至于其确切机制目前尚不完全清楚, 如能阐明他的机制, 将有助于提高自杀基因的治疗作用[3,4]. 本研究采用荧光漂白恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)观察双自杀基因系统治疗胃癌中缝隙连接与旁观者效应的关系, 为进一步研究提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK为珠江医院普外科构建; 胃癌细胞株SCG7901、宫颈癌细胞株HeLa购自中山大学试验中心细胞库; DMEM、小牛血清及TRIzol Reagent试剂盒为Gibco公司产品; 转染试剂PolyFect为QIAGEN公司提供; CD-TK引物序列为: 上游 P1 5'AAGCTTAGGCTAGCAATGTCG3', 下游P2 5'TTAGTTAGCCTCCCCCATCTC3', 由上海英俊生物有限公司合成; GCV为Roche Pharma(Switzerland)公司产品, 5-FC购自Sigma公司; Leica TCS SP2型激光共聚焦显微镜(德国).

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒鉴定: 重组腺病毒的包装、扩增与纯化, 滴度测定与鉴定见参考文献[5].

1.2.2 重组腺病毒对SCG7901细胞和HeLa细胞感染率的测定: 细胞分别用含100 mL/L小牛血清的DMEM培养, 以2×10⁵个细胞数接种于6孔培养板, 待细胞丰度达约80%, 加入不同MOI的目的腺病毒, 在37 ℃、50 mL/L CO₂孵箱内培养, 3 d后在荧光显微镜下计数GFP阳性细胞百分比.

1.2.3 RT-PCR检测转基因细胞CDglyTK基因表达: 细胞总RNA的提取按照TRIzol Reagent试剂盒说明进行, 然后按照逆转录试剂盒说明合成cDNA, 应用CDglyTK的上下游引物进行PCR反应, 1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果并拍照.

1.2.4 FRAP检测已转染和未转染的SCG7901和HeLa细胞的细胞间通讯功能: 细胞接种于Petri培养皿, 待细胞融合70%-80%时, 用MOI = 100重组腺病毒感染细胞, 24 h后每培养皿放入200 µL的5-CFDA/AM, 孵育约30 min后, 在共聚焦显微镜下观察. 淬灭细胞的激光功率为80%, 漂白脉冲时间200 ms, 计算机精确定位后, 发射激光束对选定细胞内的荧光探针进行淬灭. 激光漂白后每2 s扫描摄像1次, 获取扫描图像共60帧, 得到漂白细胞荧光的恢复及相邻接触的未漂白细胞荧光的变化情况, 观测被激光淬灭的细胞内荧光强度动态恢复过程和最终恢复水平. 荧光漂白恢复速率以每个监测细胞荧光值与初始的淬灭后荧光值相比所得的百分率计算, 即恢复率 = (poste-post1)/post1, 数据以荧光恢复速率的平均百分率加平均数的标准误差来表示.

1.2.5 FRAP观察上调剂芹黄素对SCG7901和HeLa细胞的细胞间通讯功能的影响: 实验组芹黄素溶解于DMSO后, 配成含芹黄素终浓度为10 μmol/L的培养基, 对照组加等量DMSO, 不含芹黄素. 待细胞融合70%-80%时, 加入含芹黄素的培养基, 继续培养24 h, 余步骤同1.2.4.

1.2.6 "旁观者效应"的检测及芹黄素对其的影响: 将已转染细胞和未转染细胞分别按10%︰90%和5%︰95%两种比例混合, A组: 加前药(GCV 60 g/L, 5-FU 1 000 g/L); B组: 经apigenin(10 µmol/L)预处理12 h(apigenin孵育12 h后去除)而不加前药; C组: 经apigenin预处理后加入前药; D组: 空白对照组. 72 h后MTT法检测细胞杀伤率. 按照下列公式计算杀伤效应: 杀伤效应 = (1-A_实验组/A_对照组)×100%.

统计学处理 应用SPSS13.0软件进行数据处理, 采用独立样本t检验和单向方差分析, 组间多重比较应用SNK法.

2 结果

2.1 重组腺病毒的包装、扩增、纯化以及滴度测定

重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后用PolyFect转染试剂转染293细胞, 24 h后可见GFP荧光表达, 3-5 d表达达到高峰, 7-10 d可收集细胞, 反复扩增后CsCl密度梯度离心后所得重组腺病毒滴度为2×1 0¹¹ pfu/mL.

2.2 重组腺病毒的感染效率的测定

采用不同MOI的重组腺病毒分别感染SCG7901和HeLa细胞, 96 h后观察发现: 细胞的感染率随腺病毒滴度的增加而递增, 当MOI = 1时, 仅少数细胞有荧光; 当MOI = 100时, 95%以上的GFP表达; MOI = 200时, 几乎所有的细胞均被感染, 重组腺病毒对SCG7901和HeLa细胞具有相似的感染效率.

2.3 转基因细胞CDglyTK基因表达产物的鉴定

RT-PCR检测结果显示: 感染Ad-KDR-CDglyTK的SCG7901/CD-TK、HeLa/CD-TK细胞均可见约2.5 kb阳性条带(图1).

图1 PCR检测细胞转染情况. M: Marker 250 bp DNA Ladder; 1: 转染细胞SCG7901/CD-TK(2.5 kb阳性条带); 2: 转染细胞HeLa/CD-TK(2.5 kb阳性条带).

2.4 FRAP检测已转染和未转染的SCG7901和HeLa细胞的细胞间通讯功能

光淬灭恢复技术下细胞间通讯在激光扫描共聚焦显微镜下的表现: 启动激光共聚焦显微镜, 在各种检测细胞中选择所要观察的细胞, 淬灭其荧光后进行图像扫描. 如果细胞间有通讯功能的话, 未淬灭细胞的荧光物质会通过细胞间隙连接进入淬灭细胞, 淬灭细胞的荧光强度会逐渐恢复, 约2-5 min达到稳定. 图像中观察到淬灭后的转染和未转染的SCG7901细胞的荧光强度明显降低, 随着时间的推移, 被淬灭细胞的荧光强度逐渐恢复; 而淬灭后的转染和未转染HeLa细胞荧光强度明显降低, 随时间的推移荧光强度无明显恢复. 根据显微镜上的分析软件获取每个所观察细胞的荧光恢复率, 在对照组、腺病毒组中SCG7901与HeLa细胞之间荧光恢复率相比较, 差异有统计学意义(表1).

表1 细胞在不同条件下的荧光恢复率 (n = 5, mean±SD).

	SCG7901	HeLa	t值	P值
对照组	15.04±3.24	8.67±2.52	3.472	0.008
腺病毒组	14.96±2.92	8.71±2.16	3.774	0.005
芹黄素组	35.05±4.38b	8.26±2.53	11.836	0.000
F值	51.892	0.000	-	-
P值	0.053	0.949	-	-

^bP<0. 01 vs 对照组.

2.5 FRAP观察上调剂芹黄素对SCG7901细胞和HeLa细胞的细胞间通讯功能的影响

荧光漂白恢复技术结合激光共聚焦显微镜技术在图像中观察到: 在芹黄素作用下SCG7901细胞(图2A-C)淬灭后荧光强度明显降低, 随着时间推移, 被淬灭细胞的荧光强度逐渐恢复, 在相同时间内其恢复强度较未应用上调剂的同种细胞要强; 而在芹黄素作用下的HeLa细胞(图2D-F)被淬灭后荧光强度明显降低, 随时间的推移荧光强度无明显恢复. 根据显微镜上的分析软件获取每个所观察细胞的荧光恢复率, SCG7901细胞在对照组、腺病毒组、芹黄素组间的荧光恢复率比较有统计学意义; 而HeLa细胞在对照组、腺病毒组、芹黄素组组间的荧光恢复率比较无统计学意义, 用SNK法, SCG7901细胞中芹黄素组与对照组相比, 其荧光恢复率的差别有统计学意义; HeLa细胞中芹黄素组与对照组相比, 其荧光恢复率的差别无统计学意义. 在芹黄素组中的SCG7901细胞与HeLa细胞之间荧光恢复率比较, 差异有统计学意义(表1).

图2 荧光漂白恢复技术检测细胞间的通讯功能. A: SCG7901+AP, 未淬灭前细胞荧光扫描图像; B: SCG7901+APD, 光淬灭后初始扫描图像; C: SCG7901+APD, 光淬灭后60 s扫描图像; D: HeLa+AP, 未淬灭前细胞荧光扫描图像; E: HeLa+AP, 光淬灭后初始扫描图像; F: HeLa+AP, 淬灭后60 s扫描图像.

2.6 "旁观者效应"的检测及芹黄素对其的影响

将KDR为启动子的重组腺病毒感染的SCG7901细胞、HeLa细胞分别与未感染的同种细胞以5%和10%、10%和90%的比例混合培养, 观察该体系的旁观者效应, 转基因细胞比例分别占5%、10%时, SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组组间细胞的生存率差异有统计学意义, 用SNK法, 前药+芹黄素组、前药组分别与空白组间两两相比, 差异有统计学意义. HeLa细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组组间细胞生存率间差异无统计学意义(表2). SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组中, 转基因细胞比例占5%和10%时, 两种比例细胞生存率之间分别在前药组、前药+芹黄素组中的差异有统计学意义(t = 15.06, P = 0. 000)、(t = 5.99, P = 0.001); 而两种比例细胞生存率之间分别在空白组、芹黄素组中的差异无统计学意义(t = 1.64, P = 0.152)、(t = 0.73, P = 0.492).

表2 转基因细胞比例分别占5%、10%时的旁观者效应 (n = 4, mean±SD).

	5%		10%
	SCG7901细胞	HeLa细胞	SCG7901细胞	HeLa细胞
空白组	98.33±1.24	96.76±1.30	96.79±2.74	97.12±1.15
前药组	84.22±2.35bd	96.27±1.35	58.87±2.40bd	95.24±2.23
芹黄素组	95.81±0.94	96.31±1.81	96.61±1.98	96.24±2.21
前药+芹黄素组	56.34±5.74bd	97.18±0.97	34.70±4.37bd	95.60±0.89
F值	144.420	0.386	407.82	0.895
P值	0.000	0.765	0.000	0.472

^bP<0.01 vs 空白组;

^dP<0.01 vs HeLa细胞组.

3 讨论

旁观者效应明显扩大自杀基因的杀伤作用, 只需要1%-2%的基因转染率就能成功抑制肿瘤生长. 多数学者[6,7]认为旁观者效应在自杀基因疗法中起着相当重要的作用. 至于旁观者效应的确切机制目前尚不完全清楚, 主要倾向于缝隙连接、毒性代谢产物释放, 细胞凋亡和机体免疫反应等方面.

缝隙连接理论是大家最认同的一种假说, 该理论认为, 转染自杀基因的细胞经前药作用后产生的细胞毒性物质通过细胞间的缝隙连接传递到邻近细胞, 导致未转染自杀基因的细胞死亡. 缝隙连接是细胞间的信号传导通道, 由一类称为连接素的蛋白质构成. Robe等[8]的研究表明, BSE的表达程度与缝隙连接介导的细胞间通讯(GJIC)的表达有十分密切的关系. 已知缝隙连接允许离子和小分子物质(分子量<1 000 Da或粒子直径<1.5 nm, 包括第二信使和代谢物)在细胞间作双向传递, GCV可以通过细胞膜进入细胞, 但磷酸化的GCV不能通过细胞膜, 只能通过细胞间的缝隙连接传递. 缝隙连接抑制剂甘草酸能显著抑制这一作用, 证明了缝隙连接在BSE中的作用. CD/5-FC系统引发BSE的情况则与此不同. 研究表明, 当应用缝隙连接抑制剂阻断细胞间的缝隙连接后, TK基因引起的BSE受到明显抑制, 但CD基因引起的BSE却不受影响, 说明由CD基因引发的BSE效应并不是通过细胞间的缝隙连接起作用. 有学者认为[9], 5-FC经CD基因产物转化为5-FU, 而5-FU能够自由进出细胞内外, 无需细胞间的接触即可对邻近细胞产生杀伤作用.

目前, 关于双自杀基因系统的旁观者效应的机制报道不多. 本实验首先在此系统中应用荧光漂白恢复技术结合共聚焦显微技术观察SCG7901、ECV304、HepG2、HeLa细胞的细胞间通讯功能.

迄今已有多种技术途径用于功能性缝隙连接通讯的研究, 报道的技术有: 电耦联, 经过放射活性代谢物转移的代谢协同, 基因突变所致的代谢协同, 刮除负载(scrape loading), 微注射和荧光染料转移. 这些技术操作复杂、难度大, 且都对细胞膜造成了损伤, 影响了实验结果的准确性和可行性, 使缝隙连接细胞间通讯的研究受到限制. 随着激光扫描共聚焦显微镜技术的诞生, 可以对细胞间缝隙连接的物质交换进行较为精确的测量, 从而为研究细胞间缝隙连接通讯提供了强有力的手段.

本实验结果显示: 转基因和未转基因的SCG7901细胞、HepG2细胞存在细胞间通讯功能, 而HeLa细胞不存在细胞间的通讯功能; 上调剂芹黄素可以增强SCG7901细胞、HepG2细胞细胞之间的通讯功能. 将KDR为启动子的重组腺病毒感染的SCG7901细胞、HeLa细胞与未感染的同种细胞以5%和10%、10%和90%的比例混合培养, 观察到该体系的旁观者效应, 转基因细胞比例占5%、10%时, SCG7901细胞分别在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组组间的细胞生存率差异有统计学意义. HeLa细胞分别在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组组间的细胞生存率差异无统计学意义. SCG7901细胞在空白组、前药组、芹黄素组、前药+芹黄素组中, 转基因细胞比例占5%和占10%时, 两种比例细胞生存率之间在前药组、前药+芹黄素组组间差异有统计学意义; 而在空白组、芹黄素组组间差异无统计学意义.

总之, 双自杀基因系统在存在缝隙连接的细胞中具有旁观者效应, 而且上调剂芹黄素可以增强细胞的旁观者效应, 但并未发现双自杀基因系统可以提高无缝隙连接细胞的旁观者效应, 其作用的机制有待进一步的研究.

评论

背景资料

目前, 有关单自杀基因的旁观者效应机制研究较多, 如TK基因和CD基因分别通过细胞缝隙连接和细胞介质传递毒性物质杀伤未转染自杀基因的肿瘤细胞. 而双自杀基因旁观者效应的作用机制尚不清楚.

同行评议者

葛海燕, 教授, 同济大学附属第十人民医院普通外科

研发前沿

双自杀基因如CD-TK等融合基因是近几年开始进行的研究, 但是有关双自杀基因旁观者效应的机制文献报道很少, 作用机制尚不完全清楚.

应用要点

研究双自杀基因的旁观者效应机制有助于探索提高胃癌自杀基因治疗的方法, 或据此而提出新的治疗途径, 有可能使恶性肿瘤的治疗出现一个较好的局面.

名词解释

双自杀基因疗法: 是利用基因工程的技术将2种自杀基因整合在一起, 通过载体转导入肿瘤细胞, 使其在肿瘤细胞内表达融合基因产物, 此产物具有2种自杀基因编码的酶的活性, 然后给予双药物前体治疗, 从而对2类不同的药物前体敏感, 而发挥双功能的杀伤作用.

同行评价

本文内容较新, 研究课题重要, 对胃癌的基因治疗提供了有意义的信息, 科学性、创新性与可读性均较好.

备注

编辑: 曹丽鸥 电编: 闫晋利

参考文献

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