胃癌中靶向E2F1基因的miR-331真核表达载体的构建及功能

摘要

目的: 研究构建靶向E2F1基因的miR-331真核表达载体, 评估其转染人胃癌细胞株SGC-7901细胞后对E2F1基因的干扰效果及其功能, 探讨miR-331在胃癌中可能的作用机制.

方法: 将外源性重组真核表达载体pSuper/miR-331转染到人胃癌细胞株SGC-7901内, 经G418筛选并建立高表达miR-331的稳定转染细胞株. 稳定表达该miR-331的细胞为SGC-7901-pSuper/miR-331组, 转染空质粒细胞及未处理细胞SGC-7901-pSuper组和SGC-7901组作为对照, 采用实时荧光定量PCR验证miR-331在稳定转染细胞的表达, 蛋白印迹检测其对E2F1基因表达的干扰效果和SGC-7901细胞的功能.

结果: 与SGC-7901-pSuper组相比, 转染了pSuper/miR-331高表达质粒的SGC-7901细胞中E2F1蛋白表达明显减少, 降低了4.27倍(0.206±0.037 vs 0.879±0.082, P<0.05); 与SGC-7901-pSuper组相比, 转染了pSuper/miR-331高表达质粒的SGC-7901细胞的克隆形成明显减少, 降低了3.80倍(1.863±0.098 vs 7.074±0.182, P<0.05), 而SGC-7901-pSuper组与SGC-7901组组间无统计学意义.

结论: miR-331真核表达载体构建和稳定表达胃癌细胞筛选成功, 为继续深入的研究miR-331在胃癌中的功能奠定了基础.

关键词: 胃癌; 微小RNA-331; 表达载体; SGC-7901细胞

Construction of a eukaryotic expression vector carrying the miR-331 gene

Li Cheng, Le-Ping Li, Li Zhang, Chang-Qing Jing, Tao Xu, Chen-Sheng Li, Xiao-Bo Guo

Li Cheng, Le-Ping Li, Li Zhang, Chang-Qing Jing, Tao Xu, Chen-Sheng Li, Xiao-Bo Guo, Department of Gastrointestinal Surgery, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong Province, China

Correspondence to: Xiao-Bo Guo, Department of Gastrointestinal Surgery, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong Province, China. guo992352@hotmail.com

Received: February 7, 2011
Revised: March 25, 2011
Accepted: April 11, 2011
Published online: May 18, 2011

Abstract

AIM: To explore the potential role of miR-331 in gastric carcinogenesis by constructing a eukaryotic expression vector carrying the miR-331 gene and investigating the impact of transfection with this vector on the expression of E2F1, a direct target of miR-331.

METHODS: A recombinant plasmid carrying miR-331 (pSuper/miR-331) was transfected into SGC-7901 cells by Lipofectin-mediated method. Cells stably expressing miR-331 were selected using G418. Untransfected SGC-7901 cells and those transfected with empty pSuper plasmid were used as controls. The expression of miR-331 was detected by TaqMan real-time PCR, while the expression of E2F1 protein was detected by Western blot.

RESULTS: Compared with untransfected SGC-7901 cells, the expression level of E2F1 protein exhibited a 4.27-fold decrease in cells stably expressing miR-331 (0.206 ± 0.037 vs 0.879 ± 0.082, P < 0.05). The rate of colony formation on soft agar significantly decreased in cells stably transfected with the recombinant vector when compared to control cells (1.863 ± 0.098 vs 7.074 ± 0.182, P < 0.05).

CONCLUSION: A eukaryotic expression vector stably expressing miR-331 has been successfully constructed and can be used to study the functions of miR-331 in human gastric cancer.

Key Words: Gastric carcinoma; MiR-331; Expression vector; SGC-7901 cells

0 引言

近年来, microRNA的相关研究属研究领域的热点问题. 人的miR-331(MI0000812)定位于12号染色体长臂12q22, 与人的miR-3685属于同一个家族, miR-331前体长度为94 bp, 其成熟体分为miR-331-5p和miR-331-3p. 我们前期在对miR-331-3p的研究发现miR-331-3p直接靶向细胞周期相关基因E2F1, 上调miR-331-3p的表达具有抑制胃癌细胞生长和克隆形成的能力[1]. 本研究首先通过PCR技术扩增miR-331前体357 bp扩增后, 定向克隆到microRNA真核表达载体pSUPER.neo+GFP上, 并将其转染至SGC-7901细胞株中, 筛选稳定表达miR-331胃癌细胞株SGC-7901细胞后, 采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测其对E2F1基因表达的干扰效果和SGC-7901细胞的功能. 以初步探讨miR-331在胃癌细胞的作用, 为今后深入研究该microRNA在胃癌发生发展中的作用奠定基础.

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所细胞库. 反转录酶、限制性内切酶、LA-Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司; Transwell小室、Taq DNA 聚合酶购自Promega公司; T4连接酶购自天根公司; 小量质粒抽提试剂盒购自上海申能博采公司; 大量质粒抽提试剂盒购自Qiagen公司; 低分子量标准蛋白质购自华美公司; DNA Marker、琼脂糖购自Gibco BRL公司; 蛋白Marker购自天根公司; Lipofectamine脂质体购自Invitrogen公司; microRNA抽提、逆转、定量分析购自Qiagen公司, miR-331前体引物试剂均购自Ambion公司; E2F1、GAPDH蛋白单克隆抗体购自Abcam公司; pSuper.gfp/neo空载体由本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 miR-331真核表达载体的构建: 以人胃癌细胞株SGC-7901基因组为模板扩增miR-331前体. 引物设计Pre-microRNA-331(上海生工公司合成)上游引物5'-GCGAGATCT CCTGGTACAGTCGTGGAGGT-3'. 下游引物5'- GCGCTCGAGTATAATGCCAAAGGCTGGGA -3'. 其中引入BglⅡ和XhoⅠ两个酶切位点. PCR 扩增条件94 ℃预变性5 min, 95 ℃变性30 s, 58 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环, 最后72 ℃延长10 min. 凝胶电泳鉴定可见约357 bp 目的条带. 用上海申能博采公司纯化试剂盒纯化PCR产物. BglⅡ和XhoⅠ(购于TaKaRa公司)双酶切后再次纯化得到miR-331前体目的片段. pSuper.gfp/neo载体用BglⅡ和XhoⅠ双酶切并纯化后, 插入miR-331前体目的片段, 载体构建成功后即pSuper/miR-331送博尚生物有限公司测序鉴定.

1.2.2 稳定转染胃癌细胞SGC-7901的筛选: 胃癌细胞SGC-7901用RPMI-1640(10% HYCLONE 血清)培养, 转染前1 d种6孔板, 每孔细胞数为1×10⁵个, 细胞生长至90%融合时用Lipofectamine2000脂质体进行转染. 将pSuper.gfp/neo空载体和pSuper/miR-331载体转染胃癌细胞SGC-7901转染24 h后, 加入含G418(1 000 mg/L)的培养液筛选稳定转染细胞株, 3-4 wk克隆形成后, 荧光显微镜下观察克隆的荧光显示情况, 若克隆集中显示荧光, 则挑出克隆继续扩群培养, G418改为400 mg/L的维持浓度. 最后通过定量PCR验证miR-331的表达.

1.2.3 Western blot检测E2F1蛋白表达水平: 提取细胞总蛋白, 定量, 与上样缓冲液按比例混匀, 100 ℃煮5 min, 8% SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜上, 5%脱脂牛奶室温封闭1 h, 加入一抗, 4 ℃孵育过夜, TBST洗涤3次, 每10 min换液1次. 加入二抗, 37 ℃孵育45 min, TBST洗涤3次, 每15 min换液1次, 在暗室中压片, 然后显影、定影. 图像应用AlphaImager 2200软件进行分析. 以GAPDH(单抗工作浓度为1:4 000)为内参照.

1.2.4 软琼脂克隆的形成: PBS配1.2%软琼脂, 均匀铺在6孔板底层, 待其凝固, 4 ℃保存备用, 将0.6%软琼脂与含血清培养基按1:1稀释(至0.3%软琼脂), 37 ℃恒温保存. 收集细胞并计数, 取1×10²的细胞数与适量的0.3%软琼脂充分混合, 平铺于0.6%软琼脂层之上. 细胞培养箱培养(37 ℃, 50 mL/L CO₂), 直至见到克隆形成(约3-4 wk). 用染色液染色并在显微镜下分别计数10 个不同视野含50个细胞以上的克隆数. 实验重复3 次, 取均值.

1.2.5 体外Matrigel侵袭实验: 用Transwell小室作为胃癌细胞侵袭模型, 在上室面铺一层基质胶Matrigel Matrix(50 μg/cm²), 加入1×108/L浓度的稳定转染胃癌细胞SGC-7901, 下室加入培养液, 观察两组细胞的侵袭能力.

统计学处理 用医用SPSS15.0统计软件进行分析、处理. 数据以mean±SD表示. 组间均数的比较采用单因素方差分析. 行*列表资料的率差别采用χ²检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-331重组质粒表达载体的构建

以人胃癌细胞株SGC-7901基因组为模板扩增miR-331前体, 可得到约357 bp目的条带(图1A). 将目的条带纯化后并经过BglⅡ和XhoⅠ双酶切克隆入microRNA表达载体pSuper.gfp/neo载体, 挑选阳性克隆鉴定(图1B), DNA测序表明miR-331真核表达载体构建成功.

图1 miR-331真核表达载体的构建. A: PCR扩增miR-331前体, 大小约357 bp; B: pSuper/miR-331真核表达载体双酶切鉴定, 片段大小完全正确.

2.2 RT-PCR验证miR-331的表达

在人胃癌细胞SGC-7901、转染pSuper空载体组和转染pSuper/miR-331载体组定量值分别是: 0.469±0.138、0.769±0.043和91.583±0.865, 与对照组pSuper空载体组相比较, 转染了pSuper/miR-331载体组miR-331表达量具有显著差异(P<0.05, 图2), 表明稳转细胞筛选成功.

图2 稳定转染胃癌细胞SGC-7901中miR-331定量分析. ^aP<0.05 vs pSuper.

2.3 Western blot检测E2F1蛋白表达水平

与pSuper空载体组相比, 转染了pSuper/miR-331高表达质粒的SGC-7901细胞中E2F1蛋白表达明显减少, 降低了4.27倍(0.206±0.037 vs 0.879±0.082, P<0.05). 而转染了pSuper空载体组的SGC-7901细胞组与正常组组间无统计学意义(P>0.05). 结果表明转染了miR-331的SGC-7901细胞E2F1蛋白的表达水平明显减少(图3). 实验结果表明E2F1蛋白是miR-331靶向之一.

图3 miR-331对E2F1基因表达的影响. A: miR-331高表达抑制E2F1基因表达; B: E2F1基因mRNA相对表达量降低. 1: SGC-7901; 2: pSuper; 3: pSuper/miR-331. ^aP<0.05 vs pSuper.

2.4 miR-331高表达对克隆形成和侵袭的影响

与转染pSuper空载体的SGC-7901细胞对照组相比, 转染了pSuper/miR-331高表达质粒的SGC-7901细胞的克隆形成明显减少, 降低了3.80倍(1.863±0.098 vs 7.074±0.182, P<0.05, 图4), 而转染了pSuper空载体的SGC-7901细胞组与正常组组间无统计学意义(P>0.05), 实验结果提示miR-331高表达抑制胃癌细胞SGC-7901克隆形成; 同样miR-331高表达抑制胃癌细胞SGC-7901侵袭.

图4 miR-331抑制胃癌细胞克隆形成和侵袭(×100). A-C: 克隆形成; D-F: 侵袭. A, D: SGC-7901; B, E: pSuper; C, F: pSuper/miR-331.

3 讨论

胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一, 但目前我们对胃癌的发病机制尚缺乏全面和深入的了解. 已有研究报道, 胃癌中也存在广泛的microRNA表达失调[2-6]. miRNA是近年才被发现的一类小分子单链RNA, 长度通常21-25 nt, 具有发夹样茎-环二级结构, 他主要通过与成熟mRNA的3'-UTR序列相结合, 抑制mRNA的翻译或使mRNA降解, 从而抑制基因的表达[7-10]. 成熟microRNA通过与靶基因完全(植物内)或不完全(动物内)互补结合, 促进靶基因mRNA降解或者抑制翻译, 调控基因表达, 广泛参与生命过程中一系列重要进程, 包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化[7,8,11-13]. 目前, 对于microRNA功能研究主要通过真核表达载体、体外转录以及直接合成3种方法为主. 由于RNA本身容易受RNA酶污染而降解, 合成价格昂贵、使用次数有限, 使得后两种方法的应用有限, 而采用真核表达载体, 却有独特的优势[3,14-16]. 在本研究中我们首先通过生物信息学的方法分析了miR-331, 人的miR-331(MI0000812)定位于12号染色体长臂12q22, 与人的miR-3685属于同一个家族, miR-331前体长度为94 bp, 其成熟体分为miR-331-5p和miR-331-3p. Epis等[17]在前列腺癌细胞中研究发现miR-331-3p在前列癌组织中低表达, 转染miR-331-3p前体能抑制ERBB-2基因的表达并能阻止下游PI3K/Akt雄激素受体信号通路, 通过降低雄激素刺激前列腺特异性抗原启动子活性, 抑制前列腺特异性抗原的表达; Wang等[18]通过对90个永生化淋巴母细胞系366种miRNAs和14 174 mRNAs之间关联分析研究发现, miR-331与细胞周期相关. 为了更好研究miR-331在胃癌中的作用, 本研究采用microRNA表达载体pSuper.gfp/neo载体, 此载体具有H1型启动子和绿色荧光蛋白, 当microRNA插入此载体多克隆位点时被宿主细胞Dicer酶切割, 成为成熟的microRNA. 构建的miR-331真核表达载体转染到SGC-7901细胞, 该细胞本身低表达miR-331[1], 转染进的miR-331前体能被宿主细胞Dicer酶切割, 成为成熟的miR-331, 本实验为构建microRNA表达载体提出新的思路与方法. 其次, 构建的质粒转染入细胞后可整合到细胞基因组中, 稳定表达并与绿色荧光蛋白融合表达, 绿色荧光蛋白的表达可以间接反映microRNA表达情况, 并可以衡量质粒导入细胞过程中的转染效率以及表达情况. 通过越来越多的证据显示, 人类的一些恶性肿瘤组织中microRNA基因的表达发生改变, 如肺癌[8,14]、肝癌[19]、结肠癌[15]、乳腺癌[12]、食管癌[20]. microRNA在胃癌中的调节作用也被越来越多的实验证实[3,21-25], Wan等[26]发现miR-9在人类胃癌中下调, 过表达的miR-9抑制人胃癌MGC-803细胞的生长, miR-9打靶NF-κB1, 并且调节胃癌细胞的生长. miR-150在胃癌细胞系和组织中高表达, 异位表达的miR-150促进肿瘤和胃癌细胞扩散. 荧光素酶报告基因分析表明, EGR2是miR-150的直接靶位点[27]. 人类结肠癌细胞系中, miR-200b表达上调, 加入5-氟尿嘧啶处理之后miR-200b表达下调. miR-200b抑制络氨酸磷酸酶蛋白-PTPN12, 从而使c-Abl、Src和Ras等癌基因失活[28]. 为了更好阐明miR-331在胃癌发生发展中的作用, 我们通过蛋白印迹实验显示miR-331高表达抑制细胞周期相关基因E2F1的表达, 并通过克隆形成和侵袭实验对其进行了初步探讨, 本实验发现, miR-331高表达对胃癌SGC-7901细胞的克隆形成具有明显的抑制作用, 过表达的miR-331能够抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭. 目前, 虽然已经鉴定出了大量的microRNA, 但其作用机理以及许多microRNA的生理功能还不是很清楚. 本实验构建了pSuper/miR-331真核表达载体, 通过实验证明其可在胃癌SGC-7901细胞中有效表达并转变为成熟的miR-331发挥生物学作用, 表明真核表达载体pSuper/miR-331转染细胞可用于其功能研究. 此结果为进一步研究miR-331在胃癌发生发展中的作用提供了实验基础.

评论

背景资料

胃癌在世界范围内仍是引起高死亡率的肿瘤之一,其发生发展非常复杂, 涉及到多种免疫与分子机制,与多种基因有关,包括癌基因激活和抑癌基因失活. 迄今, 有关胃癌的发生与发展的机制尚未取得突破性的进展.

同行评议者

李淑德, 主任医师, 中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科

研发前沿

近年来, microRNA的相关研究属研究领域的热点问题.

相关报道

Epis等在前列腺癌细胞中研究发现miR-331-3p在前列癌组织中低表达, 转染miR-331-3p前体能抑制ERBB-2基因的表达并能阻止下游PI3K/AKT雄激素受体信号通路, 通过降低雄激素刺激前列腺特异性抗原启动子活性, 抑制前列腺特异性抗原的表达.

应用要点

本文构建了pSuper/miR-331真核表达载体, 通过实验证明其可在胃癌SGC-7901细胞中有效表达并转变为成熟的miR-331发挥生物学作用.

同行评价

本文方法先进, 设计合理, 对胃癌的治疗有重要的指导意义.

备注

编辑:曹丽鸥 电编:李薇

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