基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-03-28; 18(9): 877-882
在线出版日期: 2010-03-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i9.877
携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达
胡刚, 汪欣, 郑启军, 万远廉, 刘玉村, 朱静
胡刚, 汪欣, 郑启军, 万远廉, 刘玉村, 北京大学第一医院普外科 北京市 100034
朱静, 北京大学第一医院外科实验室 北京市 100034
胡刚, 北京大学第一医院硕士在读, 主要从事胃肠道肿瘤的表观遗传学发病机制研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30572105.
作者贡献分布: 本课题由胡刚与郑启军共同完成; 研究过程由胡刚、郑启军及朱静操作完成; 数据分析由胡刚与郑启军完成; 本论文写作由胡刚与郑启军完成; 汪欣指导课题设计指导.
通讯作者: 汪欣, 主任医师, 副教授, 100034, 北京市西城区西什库大街38号, 北京大学第一医院普通外科. wangxin_guo@hotmail.com
电话: 010-83572430
收稿日期: 2009-12-17
修回日期: 2010-01-28
接受日期: 2010-02-01
在线出版日期: 2010-03-28

目的: 构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA, 并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.

方法: 设计合成3对Pky2基因shRNA序列, 形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGCsi空载体, 构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒; 采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列; 脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选, 获得比较单一的转染细胞; 分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.

结果: 酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误; 绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功; RT-PCR和Western blot均表明, 与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比, 转染重组表达质粒pGCsi-Pyk2 shRNA细胞中Pyk2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低.

结论: 成功构建重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA, 并证明他能降低Pyk2在Lovo细胞株系中的表达, 为进一步研究Pyk2如何调控Hic-5/ARA55, Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.

关键词: Pyk2; 结肠癌; RNA干扰; 小发夹RNA; pGCsi载体
引文著录: 胡刚, 汪欣, 郑启军, 万远廉, 刘玉村, 朱静. 携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达. 世界华人消化杂志 2010; 18(9): 877-882
Construction of shRNA expression plasmids targeting the Pyk2 gene and their expression in Lovo cells
Gang Hu, Xin Wang, Qi-Jun Zheng, Yuan-Lian Wan, Yu-Cun Liu, Jing Zhu
Gang Hu, Xin Wang, Qi-Jun Zheng, Yuan-Lian Wan, Yu-Cun Liu, Department of General Surgery, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
Jing Zhu, Surgical Laborotary of Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30572105.
Correspondence to: Associate Professor Xin Wang, Department of General Surgery, Peking University First Hospital, 38 Xishiku Avenue, Beijing 100038, China. wangxin_guo@hotmail.com
Received: December 17, 2009
Revised: January 28, 2010
Accepted: February 1, 2010
Published online: March 28, 2010

AIM: To construct the recombinant small hairpin RNA (shRNA) plasmids targeting the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) gene (pGCsi-Pyk2 shRNA) and detect their expression in Lovo cells.

METHODS: Three pairs of Pyk2 shRNA sequences were designed and ligated to the pGCsi vector that contains U6 promoter and hygromycin B to obtain shRNA expression plasmids targeting the Pyk2. The recombinant pGCsi-Pyk2 shRNA plasmids were introduced into Lovo cells by liposome-mediated transfection and selected with hygromycin B. The expression of Pyk2 mRNA and protein was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot, respectively.

RESULTS: Restriction enzyme digestion and sequence analysis showed that recombinant pGCsi-Pyk2 shRNA plasmids were successfully constructed. The expression levels of Pyk2 mRNA and protein in Lovo cells transfected with pGCsi-Pyk2 shRNA plasmids were significantly lower than those in Lovo cells transfected with empty or negative plamsids.

CONCLUSION: Recombinant pGCsi-Pyk2 shRNA plasmids are successfully constructed. Their transfection can silence the expression of Pyk2 gene in Lovo cells. The pGCsi-Pyk2 shRNA plasmids obtained lay a foundation for further study of the role of the Pyk2 gene in the pathogenesis of colorectal cancer.

Key Words: Proline-rich tyrosine kinase 2; Colon cancer; RNA Interference; Small hairpin RNA; pGCsi vector
0 引言

富含脯氨酸的非受体酪氨酸蛋白激酶2(proline-rich tyrosine kinase-2, Pyk2)是黏着斑激酶FAKs家族成员, 可能在调节细胞的增生与分化, 调节细胞的黏附和迁移能力, 调节转录因子的活性方面发挥作用. 大量的流行病学和实验研究也表明, Pyk2在结直肠癌的发生发展中有重要意义. Guo等[1]研究表明, Pyk2在正常的胃黏膜组织和胃癌组织中表达差异有显著性, 可能在胃癌的发生中起作用. Zhang等[2]研究表明, Pyk2与其他的因素是结直肠癌的预后因素. 在胃肠道肿瘤中, Pyk2作为一种潜在的抑癌基因存在. 而靳西凤等[3]报道认为RNA干扰技术对研究结肠癌的发生机制能提供强有力的支持, RNA干扰技术(siRNA)在结肠癌基础研究中也被广泛应用[4-10]. 本研究拟通过基因重组技术构建Pyk2 shRNA的真核表达载体, 并转染到Lovo结直肠癌细胞系, 研究已经表明, Lovo结直肠癌细胞系是未分化细胞株, 但其Pyk2蛋白呈高表达[11,12], 对结直肠癌的发生发展起抑制作用, 我们通过构建Pyk2 shRNA, 人为地降低Lovo细胞系中Pyk2的表达量, 为探讨Pyk2是否通过Hic-5/ARA55及Paxilion等下游通路的激活抑制肠道肿瘤的发生提供研究基础.

1 材料和方法
1.1 材料

空质粒pGCsi(带有潮霉素B抗体基因片段)购于北京毅新兴业公司, DMEM、胎牛血清、LB培养基均为Gibco公司产品, 感受态细菌购于DH-5α(全式金公司), 限制性内切酶和T4 DNA连接酶为NEB公司产品, 脂质体Lipofectamine 2000购于Invitrogen公司, Protein Ladder (10748010)购自Invitrogen公司, 鼠抗人Pyk2Ab购自Santa Cruz公司(sc-100379), RT-PCR试剂盒及DNA Ladder购自Promega公司, 结肠癌细胞株Lovo由本实验室保存.

1.2 方法

1.2.1 合成Pyk2基因干扰寡核苷酸序列: 针对Pyk2 mRNA全序列设计合成4对Pyk2基因干扰寡核苷酸序列, 即Pyk2-1, Pyk2-2, Pyk2-3, Pyk2-4经过BLAST数据库分析未发现同源序列. 其序列如下: Pyk2-1: 5'-GCTTCTATAGCAACAGCTTCA-tcaagag-TGAAGCTGTTGCTATAGAAGC-3'; 3'-GCTTCTATAGCAACAGCTTCA-aatgcag-TGAAGCTGTTGCTATAGAAGC-5', 针对131-151 bp位置; Pyk2-2: 5'-GCTACTTG CCAGAAGACTTCAT-caaga-GTGAAGTCTTCTGGCAAGTAGC-3'; 3'-GGCTACTTGCCAGAAGACTTCAT-aggtc-GTGAAGTCTTCTGGCAAGTAGC-5', 针对401-422 bp位置; Pyk2-3: 5'-GCTGTA CTCACTGCAGATATG-tcaagag-CATATCTGCAGTGAGTACAGC-3'; 3'-GCTGTACTCACTGCAGATATG-agttctc-CATATCTGCAGTGAGTACAGC-5', 针对1 581-1 602 bp位置; Pyk2-4: 5'-GGACATTGCCATGGAGCAAGA-tcaagag-TCTTGCTCCATGGCAATGTCC-3'; 3'- GGACATTGCCATGGAGCAAGA-agttatc-TCTTGCTCCATGGCAATGTCC-5', 针对2 061-2 081 bp位置.

1.2.2 Pyk2的扩增及纯化及重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA的体外构建: 根据GenBank中人Pyk2基因cDNA设计PCR引物, 从人结肠癌手术患者正常切缘组织中提取总RNA, 并用上述引物通过RT-PCR法扩增得到目的基因cDNA片段, 酶切4 h后过柱回收PCR产物. pGCsi载体经HindⅢ酶切5 h, BamHⅠ酶切4 h后加入1 μL去磷酸酶, 反应0.5 h后电泳检测, 切胶回收. 将pGCsi酶切回收后产物和PCR回收后产物用T4连接酶22 ℃连接4 h后, 取3 μL产物热休克法转入感受态细胞DH-5α(全式金公司), 37 ℃倒置培养过夜, 次日挑取单克隆, 接入LB培养基, 37 ℃振荡培养过夜. 提取菌液行PCR和电泳后将PCR鉴定正确的COMF-shRNA载体提取质粒(百泰克公司), 使用pGCsi载体上的序列为引物送测序(华大基因).

1.2.3 脂质体介导的pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染及分选: 脂质体介导的pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染及流式分选: 结肠癌细胞株Lovo体外常规培养并传代维持, 然后取状态良好的细胞以2×108/L接种于6孔板. 待细胞80%汇合时, 采用Lipofectamine 2000介导分别转染pGCsi-Pyk2 shRNA1、pGCsi-Pyk2 shRNA2、pGCsi-Pyk2 shRNA3及带有无义片段的pGCsi载体到Lovo细胞中. 转染空质粒组(pGCsi组), 同时设空白对照组, 只加入等量质脂体, 其余步骤同上, 每组设3复孔. 转染24及72 h后, 荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白表达情况, 评价转染效率. 72 h后收集各组细胞用潮霉素B分选转染和未转染的Lovo细胞.

1.2.4 RT-PCR检测目的基因Pyk2 mRNA在Lovo细胞系中的表达: 针对筛选出来的4组细胞, 选择其中的3组包括Pyk2 shRNA1, Pyk2 shRNA2, Pyk2 shRNA3, 以及转染空载体的Lovo细胞以及转染无义基因的Lovo细胞, 并以未转染载体的Lovo细胞作为对照组. 每组提取1×105个细胞, TRIzol一步法提取细胞总RNA, 先行逆转录48 ℃ 45 min, 并用先前设计的上下游引物, PCR检测Pyk2 mRNA的表达. PCR扩增的条件为: 94 ℃变性2 min, 按下述参数循环40次: 94 ℃变性30 s, 60 ℃退火1 min, 68 ℃延伸2 min; 最后68 ℃延伸7 min, 4 ℃保存. 12%琼脂糖凝胶电泳分析各组PCR产物并拍照保存.

1.2.5 Western blot检测目的蛋白Pyk2在Lovo细胞系中的表达: 选择Pyk2 shRNA1, Pyk2 shRNA2, Pyk2 shRNA3, 并以未转染载体的Lovo细胞, 转染空载体的Lovo细胞以及转染无义基因的Lovo细胞作为对照组. 每组取5×106个细胞, 加100 μL细胞裂解液和2 μL蛋白酶抑制剂, 提取细胞总蛋白. 取50 μg细胞总蛋白, 10% SDS-PAGE电泳, 转硝酸纤维素膜, 1:500稀释的鼠抗人Pyk2单抗, 碱性磷酸酶标记的兔抗鼠二抗, DAB显色, Western blot检测细胞内Pyk2的蛋白表达水平.

2 结果
2.1 重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA酶切鉴定及测序分析

选择Pyk2基因上4个位点, 设计引物行PCR后行12%琼脂糖凝胶电泳分析(图1). 结果显示4个样本的Pyk2均能有效扩增, 片段大小为50 bp左右. 将pGCsi酶切回收后产物和PCR回收后产物分别采用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ双酶切, 并转入感受态细胞, 提取菌液行PCR并行PCR产物的12%琼脂糖凝胶电泳分析(图2). 结果显示仅转染了空载体的质粒扩增片段为260 bp左右的片段, 而转染了含4种Pyk2片段的质粒的扩增片段均为310 bp左右. 说明空质粒pGCsi中已插入Pyk2 shRNA片段, 且插入方向无误. 选取经酶切鉴定正确的重组质粒进行核苷酸序列测定, 结果表明, 测序序列与GenBank中人Pyk2基因原始序列完全相同, 重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA构建成功(图3).

图1
图1 Pyk2扩增后电泳图. 1-4: 4个样本的PCR产物; 5, 6: 两个阴性对照; 7: DNA Marker.
图2
图2 转染4个位点质粒菌液及空载体PCR结果. 1: DNA Marker; 2-6分别为位点1、位点2、空载体、位点3、位点4的PCR产物.
图3
图3 含四个位点Pyk2 shRNA片段的质粒1, 2, 3, 4测序结果. A-D分别为选择的4个位点, 经测序显示其核苷酸序列与其数据库中的原始序列一致.
2.2 RT-PCR检测转染Pyk2 shRNA的Lovo细胞系中Pyk2 mRNA表达明显降低

转染24 h后在荧光显微镜下观察可见, 除空白对照组未有明显的绿色荧光外, pGCsi-Pyk2 shRNA1, 2, 3组, 仅转染无义基因片段的载体组和pGCsi空载体组细胞都能发出特异性的绿色荧光(图4), 经潮霉素B分选转染的细胞. 提取RNA后行RT-PCR, 12%琼脂糖凝胶电泳分析(图5). 结果显示未转染载体的Lovo细胞, 转染空载体的Lovo细胞以及转染无义基因的Lovo细胞中Pyk2的表达量明显高于转染Pyk2 shRNA1, 2, 3质粒的Lovo细胞. 说明Pyk2 shRNA能有效地抑制Lovo细胞中Pyk2 mRNA的表达.

图4
图4 转染了3种siRNA质粒、无义基因、空载体及空白对照的绿色荧光照. A: Lovo细胞; B: 转染空载体的Lovo细胞; C: 仅转染无义基因的Lovo细胞; D: Pyk2 shRNA1; E: Pyk2 shRNA2; F: Pyk2 shRNA3.
图5
图5 经质粒转染后Lovo细胞系中Pyk2 mRNA的表达. 1: 阳性对照; 2: Lovo细胞; 3: 转染空载体的Lovo细胞; 4: 仅转染无义基因的Lovo细胞; 5: Pyk2 shRNA1; 6: Pyk2 shRNA2; 7: Pyk2 shRNA3.
2.3 Western blot检测转染Pyk2 shRNA的Lovo细胞系中Pyk2蛋白表达明显降低

选择转染Pyk2 shRNA1, 2, 3的Lovo细胞系, 以未转染载体的Lovo细胞, 转染空载体的Lovo细胞以及转染无义基因的Lovo细胞为对照. 提取细胞总蛋白, 以每个样本100 μg蛋白进行SDS-PAGE, 用Pyk2单抗进行Western blot检测, 以b-actin为内参(图6). 结果显示转染了Pyk2 shRNA1, 2, 3的Lovo细胞中Pyk2蛋白的表达均明显低于对照组中Pyk2蛋白的表达量. 而内参表达量基本一致, 说明转染的Pyk2 shRNA质粒能有效降低Lovo细胞中Pyk2蛋白的表达.

图6
图6 Western blot检测Pyk2表达. 1: Lovo细胞; 2: 转染空载体的Lovo细胞; 3: 仅转染无义基因的Lovo细胞; 4: Pyk2 shRNA1; 5: Pyk2 shRN A2; 6: Pyk2 shRNA3.
3 讨论

Pyk2是非受体酪氨酸蛋白激酶FAKs家族的成员, 在多种组织中都有Pyk2的表达如在神经组织、造血组织以及小肠、肾、脾、附睾、胃肠、前列腺等[13-17]. Pyk2主要依赖Ca2+浓度[18,19]或PKC参与细胞内的MAPK、PI3K[20,21]或JNK等信号通路转导, 将胞外信息与胞内效应分子联系起来, 催化多种含SH2结构域的底物蛋白磷酸化, 在调节细胞的增生与分化、细胞骨架重组、黏附和迁移以及一些转录因子的活性中发挥作用, 目前的研究发现, 在胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌等常见肿瘤的发生发展过程的不同阶段发挥着重要的作用[23-33]. 然而, 目前的研究表明, Pyk2在不同部位的肿瘤发生的作用不完全一样. Iiizumi等[25]发现在前列腺癌中, RhoC通过激活Pyk2促进前列腺癌的转移; Vitale等[26]发现Pyk2在cAMP信号通路介导的前列腺癌浸润及核分化中发挥作用; Wang等[30]对Pyk2在前列腺癌细胞中的作用机制进行了研究, 发现Pyk2通过与下游的信号分子ARA55(Hic-5)相互作用并使其磷酸化, 间接改变了雄激素受体的活性, 从而控制前列腺癌细胞的生长; Sun等报道Pyk2通过激活c-Src/ERK通路促进肝细胞癌的增殖和浸润[31,32]. 然而在胃肠道肿瘤中, Pyk2却作为一种抑癌基因而存在, Zhang等[2]报道Pyk2在结直肠癌中低表达, 是结直肠癌的预后指标; Guo等[1]报道Pyk2在胃癌组织中表达明显降低, 其降低程度与胃癌的分期及恶性程度正相关; Cui等[34]报道Pyk2的下游基因Hic-55/ARA55能减少结直肠癌细胞的生长及促进癌细胞的凋亡.

我们构建的Pyk2 shRNA的真核表达载体pGCsi-Pyk2 shRNA经限制性核酸内切酶酶切鉴定、DNA测序证实目的基因Pyk2序列与数据库中相应序列一致, 质粒构建成功; 我们进一步将脂质体介导pGCsi-Pyk2 shRNA质粒稳定转染到Lovo结肠癌细胞中, 通过绿色荧光等实验方法筛选稳定转染的细胞, 然后通过RT-PCR及Western blot方法检测各组细胞中Pyk2的mRNA和蛋白的表达水平差异, 结果表明, 在高表达Pyk2的Lovo结肠癌细胞中转染Pyk2 shRNA后, Pyk2 mRNA和蛋白的表达均明显下降.

目前还没有文献明确报道Pyk2通过何种信号通路介导影响结肠癌的发生发展, 可能与其下游的Hic-5/ARA55及Paxillion等相关, 其在人体的各种肿瘤中的作用也未有定论, 我们构建Pyk2 shRNA质粒, 希望为以后研究Pyk2在结肠癌及其他肿瘤的抗肿瘤治疗中的角色奠定基础.

评论
背景资料

大量的研究证据表明, Pyk2在调节细胞的增生与分化、细胞骨架重组、黏附和迁移以及一些转录因子的活性中发挥作用, 与人类肿瘤的发生密切相关.

同行评议者

葛海燕, 教授, 同济大学附属第十人民医院普通外科; 王石林, 主任医师, 中国人民解放军空军总医院普通外科.

研发前沿

研究表明Pyk2通过对下游的Hic-5/ARA55, Paxillion等基因的调控, 与降低人类结直肠癌的发病相关, 在结直肠癌中作为一种潜在的抑癌基因发挥作用.

相关报道

国外已有报道FHIT基因过表达能增加胰腺癌细胞系对外源性凋亡诱导剂的敏感性. 体内实验结果显示FHIT基因的转导能阻止肿瘤的生长, 延长模型小鼠的生存时间, 抑制暴露致癌环境下小鼠体内肿瘤的产生.

创新盘点

本文采用RNA干扰技术体外构建Pyk2 shRNA的真核表达质粒, 并在脂质体的介导下转染进入Lovo结肠癌细胞株, 降低其在Lovo细胞系中的表达, 为研究Pyk2的抑癌作用提供条件.

同行评价

本文选题合理, 设计得当, 结论可靠, 且具有一定参考价值.

编辑:李军亮 电编:何基才

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