基础研究
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世界华人消化杂志. 2010-03-28; 18(9): 877-882
Published online 2010-03-28. doi: 10.11569/wcjd.v18.i9.877
携带Pyk2基因的shRNA质粒构建及其在Lovo结肠癌细胞系中的表达
胡刚, 汪欣, 郑启军, 万远廉, 刘玉村, 朱静
胡刚, 汪欣, 郑启军, 万远廉, 刘玉村, 北京大学第一医院普外科 北京市 100034
朱静, 北京大学第一医院外科实验室 北京市 100034
胡刚, 北京大学第一医院硕士在读, 主要从事胃肠道肿瘤的表观遗传学发病机制研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30572105.
作者贡献分布: 本课题由胡刚与郑启军共同完成; 研究过程由胡刚、郑启军及朱静操作完成; 数据分析由胡刚与郑启军完成; 本论文写作由胡刚与郑启军完成; 汪欣指导课题设计指导.
通讯作者: 汪欣, 主任医师, 副教授, 100034, 北京市西城区西什库大街38号, 北京大学第一医院普通外科. wangxin_guo@hotmail.com
电话: 010-83572430
收稿日期: 2009-12-17
修回日期: 2010-01-28
接受日期: 2010-02-01
在线出版日期: 2010-03-28
Abstract

目的: 构建重组质粒PGCsi-Pyk2 shRNA, 并检测所引起的Pyk2 mRNA和蛋白在Lovo结肠癌细胞系中的表达.

方法: 设计合成3对Pky2基因shRNA序列, 形成双链后将其依次连入带有U6启动子并含有潮霉素B的pGCsi空载体, 构建成能产生Pyk2短发卡RNA的质粒; 采用双酶切和测序分析鉴定插入基因的序列; 脂质体介导重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA稳定转染Lovo细胞系并通过潮霉素B筛选, 获得比较单一的转染细胞; 分别采用RT-PCR、Western blot等检测转染前后Pyk2的水平表达.

结果: 酶切鉴定和测序分析表明重组表达质粒pGCsi-Pyk2 shRNA构建无误; 绿色荧光照相及PCR表明质粒转染成功; RT-PCR和Western blot均表明, 与转染空质粒PGCsi组和转染仅含免疫荧光基因组细胞相比, 转染重组表达质粒pGCsi-Pyk2 shRNA细胞中Pyk2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低.

结论: 成功构建重组质粒pGCsi-Pyk2 shRNA, 并证明他能降低Pyk2在Lovo细胞株系中的表达, 为进一步研究Pyk2如何调控Hic-5/ARA55, Paxillion等下游靶基因的表达和参与结肠癌表观遗传学发生机制奠定了基础.

Keywords: Pyk2; 结肠癌; RNA干扰; 小发夹RNA; pGCsi载体