临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-09-08; 18(25): 2702-2706
在线出版日期: 2010-09-08. doi: 10.11569/wcjd.v18.i25.2702
血清AFP、GPC3、VEGF、IGF-Ⅱ单独及联合检测对原发性肝细胞癌的诊断价值
李鹏, 翟云, 刘晖, 吕福东, 李宁, 丁惠国
李鹏, 翟云, 李宁, 丁惠国, 首都医科大学附属北京佑安医院肝病消化中心 北京市 100069
刘晖, 吕福东, 首都医科大学附属北京佑安医院病理中心 北京市 100069
基金项目: 国家十一五重大专项基金资助项目, No. 2008ZX10002-015; 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室开放基金资助课题, No. 2009CASPMI-004.
作者贡献分布: 李鹏与翟云负责临床病例随访、测定及统计学分析; 刘晖与吕福东负责病理分析; 李鹏与丁惠国完成论文; 李宁与丁惠国为项目负责人并对全文负责.
通讯作者: 丁惠国, 教授, 100069, 北京市, 首都医科大学附属北京佑安医院肝病消化中心. dinghuiguo@medmail.com.cn
电话: 010-83997155 传真: 010-63295525
收稿日期: 2010-06-25
修回日期: 2010-07-28
接受日期: 2010-08-03
在线出版日期: 2010-09-08

目的: 分析血清AFP、GPC3、VEG、IGF-Ⅱ单独及联合检测对原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的诊断价值.

方法: 66例经病理确诊的HCC患者和16例肝炎肝硬化患者, 采用微粒子酶联免疫法测定血清AFP, ELISA检测GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ. AFP≥400 μg/L作为诊断HCC临界值, 根据ROC曲线确定GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ的最佳临界值.

结果: 单独分析4个指标对HCC诊断价值: 其敏感度依次为GPC3>IGF-Ⅱ>AFP>VEGF, 特异度依次为AFP>GPC3>VEGF>IGF-Ⅱ. AFP联合其他指标, 以AFP+GPC3诊断效能最高. 其中, AFP<20 μg/L HCC患者, GPC3的阳性率最高达51.1%, 早期HCC(BCLC, Stage A)患者, GPC3阳性率高达50.0%.

结论: 血清AFP≥400 μg/L对HCC患者诊断有较大局限性, AFP联合GPC3明显提高HCC的诊断效能, 值得扩大病例数进一步研究.

关键词: 原发性肝细胞癌; ROC曲线; 血清肿瘤标志物; 诊断
引文著录: 李鹏, 翟云, 刘晖, 吕福东, 李宁, 丁惠国. 血清AFP、GPC3、VEGF、IGF-Ⅱ单独及联合检测对原发性肝细胞癌的诊断价值. 世界华人消化杂志 2010; 18(25): 2702-2706
Diagnostic value of serum AFP alone or in combination with glypican 3, VEGF or IGF-II for patients with primary hepatocellular carcinoma
Peng Li, Yun Zhai, Hui Liu, Fu-Dong Lv, Ning Li, Hui-Guo Ding
Peng Li, Yun Zhai, Ning Li, Hui-Guo Ding, Department of Hepatology and Gastroenterology, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Hui Liu, Fu-Dong Lv, Department of Pathology, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China
Supported by: the State Key Project Specialized for Infectious Diseases, No. 2008ZX10002-015; the Open Fund of CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, No. 2009CASPMI-004.
Correspondence to: Professor Hui-Guo Ding, Department of Hepatology and Gastroenterology, Beijing Youan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100069, China. dinghuiguo@medmail.com.cn
Received: June 25, 2010
Revised: July 28, 2010
Accepted: August 3, 2010
Published online: September 8, 2010

AIM: To evaluate the diagnostic value of serum alpha-fetoprotein (AFP) alone or in combination with glypican 3 (GPC3), vascular endothelial growth factor (VEGF) or insulin-like growth factor-II (IGF-II) for patients with primary hepatocellular carcinoma (HCC).

METHODS: Serum AFP, GPC3, VEGF and IGF-II were measured by enzyme-linked immunosorbent assay in 66 patients with histopathologically proven HCC and 16 cirrhotic patients. The cut-off level of AFP for diagnosis of HCC was 400 μg/L, while those of GPC3, VEGF and IGF-II were determined using ROC curve analysis.

RESULTS: The sensitivity of serum GPC3 for diagnosis of HCC was highest, followed by serum IGF-II , AFP and VEGF. The specificity of serum AFP for diagnosis of HCC was highest, followed by serum GPC3, VEGF and IGF-II. AFP in combination with GPC3 was most useful for diagnosis of HCC, especially early HCC. In AFP-negative HCC patients, the positive rate of GPC3 was 51.1%. In patients with early HCC (BCLC stage A), the positive rate of GPC3 was 50.0%.

CONCLUSION: Detection of serum AFP (≥400 μg/L) alone has its imitations in the diagnosis of HCC. AFP in combination with GPC3 is most useful for diagnosis of HCC, especially early HCC.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; ROC curve; Tumor biomarker; Diagnosis
0 引言

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤之一, 特别是在慢性肝炎肝硬化的基础上发展为肝癌, 较高的发病率和病死率[1-3]. 在中国, 慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化是肝癌的高危人群, 尽管有规范的监测方案和指标, 但是目前仍缺乏理想的肝癌血清筛查指标, 特别是早期肝癌的血清标志物[4]. 因此, HCC临床确诊时大多数患者为于中、晚期, 缺乏有效治疗手段, 预后差. 尽管甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)作为HCC筛查、诊断的血清学标志物应用于临床已有40余年[4,5], 但是, 近年国内外不断有报道, 30%-40%早期、可切除性HCC患者血清AFP<20 μg/L[6], 其他血清肿瘤标志物在HCC诊断上都有其优势和局限性[4]. 因此, 联合多种血清肿瘤标志物监测和诊断HCC是近年来肝癌实验室诊断的发展趋势[7,8]. 本研究分析了AFP、磷脂酰基醇蛋白聚糖-3(glypican-3, GPC3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)单独及联合检测对HCC诊断的价值.

1 材料和方法
1.1 材料

首都医科大学附属北京佑安医院2006- 01/2008-12住院的经手术或肝脏穿刺病理诊断的原发性肝癌患者66例, 男48例, 女18例, 年龄28-78岁. 全部HCC患者行B-超(LOGIQ9, GE公司, 美国)及64排CT检查(GE HISPEED DXI, GE公司, 美国). 其中, 早期肝癌(Stage A)14例, 符合巴塞罗那HCC分期标准[9]. 同期肝硬化患者16例, 男12例, 女4例, 年龄22-71岁. 肝硬化符合以下诊断标准: (1)有明确慢性肝病史或体征, (2)门静脉高压症表现, (3)B-超或CT检查符合肝硬化表现.

1.2 方法

1.2.1 检测: 空腹采集外周血2 mL, 无溶血、脂血, 2 000 r/min离心8 min, 分离血清, -20 ℃保存. 采用微粒子酶联免疫法测定血清AFP, (ABBOTT AXSYM全自动免疫分析仪, 试剂盒购自美国雅培公司). 采用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测血清GPC3(美国BioMosaics公司)、VEGF(美国ADL公司)及IGF-Ⅱ(美国BECKMAN COULTER公司), 酶联斑点分析仪(EliSpot 04 SR, 德国AID公司)测定A值, 严格按试剂盒说明操作.

1.2.2 Cut-off值确定: AFP按2001年中国抗癌协会肝癌专业委员会制定的标准, AFP≥400 μg/L为阳性[4]. 应用SPSS16.0绘制受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve, ROC), 以曲线下面积最大确定GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ最佳临界值, GPC3≥300 ng/L为阳性, VEGF≥30.5 ng/L为阳性, IGF-Ⅱ≥1 250 ng/L为阳性.

1.2.3 HBV-M、HCV检测: 电化学发光法测定HBV-M(Roche, 170电化学发光仪, 德国); 采用ELISA检测抗HCV(MK3型酶标仪[芬兰], 试剂购自意大利DiaSorin公司).

1.2.4 肝脏生化及凝血指标测定: ALT、AST、总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)测定采用全自动生化分析仪(AU5400, 奥林巴斯公司, 日本)测定. 凝血酶原时间(PT)测定采用比浊法(AcL Top, 库尔特公司, 美国). 凝血酶原活动度(PTA%) = (对照PT-对照PT×0.6)/(病患者PT-对照PT×0.6)×100%.

统计学处理 应用SPSS16.0统计软件进行统计分析, 计量资料以mean±SD表示, 均数比较采用方差分析, 计数资料及率的比较采用χ2检验. 应用敏感度[a/(a+c)], 特异度[(d/(b+d)], 诊断优势比(a×d/b×c)及准确度[(a+d)/(a+b+c+d)], 评价上述指标单独及联合诊断HCC的效能. 联合检测的判断标准: 组合中只要有一项超过临界值, 即判断为阳性; 组合中所有值均低于临界值, 即判断为阴性. (a为真阳性病例数; b为假阳性病例数; c为假阴性病例数; d为真阴病例性数).

2 结果

两组患者基本临床特征见表1.

表1 各组患者基本临床特征 (mean±SD).
指标HCC肝硬化P值
年龄57.1±9.352.8±9.8>0.05
性别(男/女)48/1812/4>0.05
ALT147.525.0<0.01
ALT/AST10.670.63>0.05
Child
A182>0.05
B267>0.05
C227>0.05
HBeAg(+)186>0.05
HCV(+)53>0.05
1ALT及ALT/AST数据非正态分布, 以中位数表示采用秩和检验.
2.1 血清AFP、GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ单独测定对HCC的诊断价值

其敏感度依次为GPC3>IGF-Ⅱ>AFP>VEGF, 特异度: AFP>GPC3>VEGF> IGF-Ⅱ, 准确度: GPC3>IGF-Ⅱ>AFP>VEGF. 敏感度及准确度GPC3最高, 特异度AFP虽高于GPC3, 但两者差异无统计学意义(P>0.05), 故单独诊断GPC3效能最高(表2).

表2 AFP、GPC3、VEGF、IGF-Ⅱ单独及联合诊断HCC的效果 %(n/n).
指标敏感度特异度准确度
AFP28.8(19/66)100.0(16/16)43.9(35/82)
GPC347.0(31/66)93.8(15/16)56.1(46/82)
VEGF24.2(16/66)81.3(13/16)35.4(29/82)
IGF-Ⅱ39.4(26/66)75.0(12/16)46.3(38/82)
AFP+GPC365.2(43/66)93.8(15/16)70.7(58/82)
AFP+VEGF44.0(29/66)81.3(13/16)51.2(42/82)
AFP+IGF-Ⅱ54.6(36/66)75.0(12/16)58.5(48/82)
GPC3+VEGF59.1(39/66)81.3(13/16)63.4(52/82)
GPC3+IGF-Ⅱ66.7(44/66)68.8(11/16)67.1(55/82)
VEGF+IGF-Ⅱ50.0(33/66)62.5(10/16)52.4(43/82)
AFP+GPC3+VEGF69.7(46/66)81.3(13/16)72.0(59/82)
AFP+GPC3+IGF-Ⅱ75.8(50/66)68.8(11/16)74.4(61/82)
AFP+VEGF+IGF-Ⅱ62.1(41/66)62.5(10/16)62.2(51/82)
GPC3+VEGF+ IGF-Ⅱ71.2(47/66)62.5(10/16)69.5(57/82)
AFP+GPC3+VEGF+IGF-Ⅱ78.8(52/66)62.5(10/16)75.6(62/82)
2.2 四种指标联合检测HCC的结果

AFP联合GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ, 其敏感度依次为AFP+ GPC3>AFP+IGF-Ⅱ>AFP+VEGF, 特异度及敏感度AFP+GPC3最高. 且AFP+GPC3优于任一单独指标. 三项及四项指标联合检测敏感性及准确度虽有所升高, 但幅度小, 且特异度下降明显; 与AFP+GPC3比较, 其敏感度及特异性无明显差异(P>0.05).

2.3 各标志物阳性率

以曲线下面积最大确定GPC3、VEGF及IGF-Ⅱ最佳临界值, GPC3≥300 ng/L为阳性, VEGF≥30.5 ng/L为阳性, IGF-Ⅱ≥1 250 ng/L为阳性(图1). 在早期肝癌患者中, GPC3阳性率为50.0%(7/14)>VEGF: 14.3%(2/14)>IGF-Ⅱ: 7.1%(1/14)>AFP: 0(0/14), 高于其他三个指标(P<0.01, 图2). 在AFP<400 μg/L的47例患者, GPC3阳性率为51.1%(24/47)> IGF-Ⅱ: 36.2%(17/47)>VEGF: 21.3%(10/47).

图1
图1 ROC曲线确定GPC3、VEGF、IGF-Ⅱ的Cut-off值. A: GPC3的ROC曲线; 曲线下最大面积0.684, 95%CI: 0.579-0.789; B: VEGF的ROC曲线; 曲线下最大面积0.453, 95%CI: 0.314-0.593; C: IGF-Ⅱ的ROC曲线; 曲线下最大面积0.481, 95%CI: 0.331-0.632.
图2
图2 早期肝癌患者各标志物阳性率. A: 各期HCC患者GPC3联合AFP诊断敏感性明显增加; B: 各标志物阳性率依次为GPC3: 50%, VEGF: 14.3%, IGF-Ⅱ: 7.1%, AFP: 0.
3 讨论

原发性肝癌是我国常见肝脏肿瘤, 其中HCC占90%左右, 我国每年约有11万人死于原发性肝癌, 占世界肝癌死亡人数45%[2]. 在高危人群中, 早期监测和诊断可显著提高肝癌的远期生存率[6,10]. 理想的肿瘤标志物应是特异性强、敏感度高、表达量或血清中水平与肿瘤组织发展或大小呈正相关. 目前临床上尚无单一标志物能够明确诊断. 迄今, AFP作为HCC筛查、诊断的血清学标志物应用于临床已有40余年[11,12]. 中国抗癌协会肝癌专业委员会AFP对HCC的诊断临界值定为400 μg/L[13]. 但是, 近年国内外不断有报道, 以此为临界值诊断HCC的敏感性低于50%, 30%-40%早期、可切除性HCC患者血清AFP<20 μg/L[4,5]. 近年来也有研究报道, HCC患者血清AFP水平与地区、种族、ALT及病毒感染等因素有关, AFP不同诊断临界值其敏感性和特异性差别很大, 并且认为对于肝硬化患者发生HCC, AFP的诊断及筛查价值很差[11,14,15]. 目前国内研究显示: AFP以20 μg/L为阳性界值, 诊断HCC的敏感度为40%-65%, 特异度为76%-96%不等[12]. 当AFP≥400 μg/L时, 敏感度约30%-40%, 特异度可达99%以上[4,14], 但往往肿瘤体积较大, 多为巨块型或弥漫型, 并更易侵犯门静脉, 中位生存率低, 预后差. 而且在良性肝病中AFP也有增高, 故单独应用AFP诊断HCC有一定的局限性.

GPC3是一种由磷脂酰糖基固定在细胞膜上的硫酸乙酰肝素聚糖蛋白, 他在细胞增殖与分化的发展、调节过程中发挥重要作用[16]. 研究发现: 血清GPC3的水平与患者性别、年龄、HBV感染、门静脉癌栓、肝内转移无相关, 而与肿瘤大小与分化程度有关, 且其血清浓度与AFP的浓度无相关性, 在AFP阴性的HCC, 尤其是早期HCC的诊断中有重要作用[17,18]. VEGF是肿瘤组织中最重要的血管生成因子, 通过与其受体结合, 直接刺激内皮细胞的增殖, 并增加血管的通透性, 为肿瘤细胞的增殖、脱落和扩散创造条件. 有研究显示: HCC患者血清中VEGF的浓度与HCC的分期、分化, 肿瘤的进展和预后有关[19], 故也可作为HCC的血清学诊断标志物. IGF-Ⅱ是胰岛素密切相关的促有丝分裂多肽. 他能促进细胞分裂、分化和增殖, 肝脏是合成和分泌IGF-Ⅱ的主要器官. 肝癌细胞能分泌大量的IGF-Ⅱ, 通过自分泌或旁分泌生长刺激机制, 促进癌前期肝细胞的异常增殖和分化, 增加癌前肝细胞的突变机率, 并在一定条件下加速其恶性转化. 有研究发现[4,20]: IGF-Ⅱ在AFP阴性的HCC中有35%呈现阳性, 且与肿瘤大小无关. 故有望作为AFP阴性病例的补充诊断指标.

随着HCC的早期诊断技术和方法的发展, AFP呈阴性或低浓度的肝癌病例不断增多, 其原因尚不清楚. 为了提高肝癌患者的诊断率, 很多学者尝试应用AFP联合其他肿瘤标志物对HCC进行诊断, 均取得一定效果[6,8,14,21]. 本研究显示, 应用单个指标诊断时, 当AFP≥400 μg/L, 诊断的特异度能达到100.0%, 但敏感度只有28.8%, GPC3的特异度为93.8%, 与AFP比较差异无统计学意义, 而敏感度及准确度GPC3在上述指标中最高, 故单一指标中GPC3的诊断效能最高. 当联合多项指标进行诊断时发现, AFP联合GPC3诊断时, 特异度为93.8%, 准确度为70.7%. 当四项指标联合应用时, 敏感度虽达到78.8%, 但特异度下降至62.5%. 因此, AFP联合GPC3的诊断效能最高. 此外, 在AFP阴性的肝癌, 尤其是早期肝癌中, GPC3的阳性率均达到50%左右, 高于VEGF、IGF-Ⅱ.

因此, 在HCC的血清学诊断中, 特别早期HCC, 血清GPC3是AFP 最重要互补指标, AFP联合GPC3可显著提高HCC诊断的灵敏度和特异性, 值得扩大病例数进一步研究.

评论
背景资料

HCC是常见的恶性肿瘤之一, 目前仍缺乏理想的肝癌血清筛查指标, 甲胎蛋白作为目前最常用的肝癌血清标志物, 敏感性低, 且在良性肝病中有假阳性, 寻找新的HCC血清标志物仍是临床亟待解决的重要课题.

同行评议者

孙殿兴, 主任医师, 白求恩国际和平医院肝病科

研发前沿

联合多种血清肿瘤标志物监测和诊断HCC, 是近年来肝癌实验室诊断的发展趋势. HCC患者血清GPC3增高与AFP无相关性, 在早期HCC诊断中具有一定价值.

相关报道

文献报道血清AFP联合AFP-L3、CEA、CA19-9、GGT及DCP等较单独AFP, 其诊断敏感性不同程度的提高. 但未涉及本文的几种标志物的联合诊断研究.

创新盘点

血清AFP≥400 μg/L对HCC患者诊断有较大局限性, 敏感性28.8%; AFP联合GPC3明显提高HCC, 特别是早期HCC的诊断效能.

应用要点

GPC3是AFP最重要互补指标, AFP联合GPC3可显著提高HCC诊断的灵敏度和特异性, 在HCC及高危人群中的监测, 血清学诊断值得应用.

同行评价

本研究内容新颖且重要, 提供了许多有意义的信息, 对肝癌的早期诊断具有重要的意义.

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

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