结肠癌Lovo细胞RUNX3基因的表达与其增殖及凋亡的关系

摘要

目的: 探讨5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠癌Lovo细胞增殖凋亡及抑癌基因RUNX3表达的影响. 

方法:  用特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR 0.4, 4, 40 μmol/L处理人结肠癌细胞株Lovo 3 d, 继续常规培养5 d后, 采用四唑盐法(MTT)比色法观察细胞经药物处理前后的生长活性, 以半定量RT-PCR检测细胞处理前后抑癌基因RUNX3 mRNA的表达, 以甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR, MSP)检测细胞处理前后RUNX3的甲基化状态, 应用流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测.

结果: 与对照组相比, 0.4, 4, 40 μmol/L的5-Aza-CdR处理细胞后, 细胞RUNX3 mRNA的相对表达量(0.46±0.06, 0.71±0.06, 0.84±0.07 vs 0, P<0.01)和细胞凋亡率均增高(10.95%±2.09%, 17.61%±1.51%, 26.60%±1.89% vs 2.92%±0.93%, P<0.01), 呈剂量依赖性(F = 168.4, F = 145.7), 结肠癌Lovo细胞生长速率下降, RUNX3 mRNA重新表达, 其基因启动子区域部分甲基化.

结论:  5-Aza-CdR可逆转RUNX3启动子高甲基化状态, 抑制细胞生长, 诱导部分细胞凋亡.

关键词: RUNX3基因; 甲基化; 5-氮-2'-脱氧胞苷; 四唑盐比色法; 流式细胞术; 聚合酶链反应

Relationship between tumor suppressor gene RUNX3 expression and cell proliferation and apoptosis in colonic cancer cell line Lovo

Zhi Ni, Man-Xi Bao, Nan-Zhi Liu, Qiu Zhao, Hua Qin, Yan Yang, Yi-Jian Qiu, Ting-Ting Wang

Zhi Ni, Man-Xi Bao, Yan Yang, Yi-Jian Qiu, Ting-Ting Wang, Department of Gastroenterology, Hainan Corps Hospital, Chinese People Armed Police Army, Haikou 570203, Hainan Province, China

Nan-Zhi Liu, Qiu Zhao, Hua Qin, Department of Gastroenterology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Correspondence to: Zhi Ni, Department of Gastroenterology, Hainan Corps Hospital, Chinese People Armed Police Army, 49 Wenming Eastern Road, Haikou 570203, Hainan Province, China. hknizhi@163.com

Received: July 5, 2007
Revised: February 19, 2008
Accepted: February 27, 2008
Published online: March 8, 2008

Abstract

AIM: To investigate the expression and methylation status of tumor suppressor gene RUNX3 in human colon cancer cell line Lovo and explore the effects of 5-aza-2'-deoxycytidine (5-Aza-CdR) on the proliferation and apoptosis of Lovo cells and the expression of RUNX3 gene.

METHODS: Human colon cancer cell line Lovo was treated with 5-Aza-CdR, a specific methyltransferase inhibitor, at the concentrations of 0.4, 4 and 40 μmol/L for 3 d, and then cultured in RPMI 1640 medium for 5 d. The activation of Lovo cells was respectively observed by Tetrazolium salt colorimetric (MTT) assay before and after 5-Aza-CdR treatment. The change in expression of RUNX3 mRNA was observed by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The apoptosis was analyzed by flow cytometry. The methylation status of gene promoter was determined by methylation-specific PCR (MSP).

RESULTS: Lovo cells treated with 5-Aza-CdR (0.4, 4, 40 μmol/L) displayed a slowed growth rate in different degrees in contrast with those in the control group and their growth rates decreased accordingly with the increase of 5-Aza-CdR concentration. There were significant increases in RUNX3 mRNA expression (0.46 ± 0.06, 0.71 ± 0.06, 0.84 ± 0.07 vs 0, P < 0.01) and apoptotic rates of Lovo cells (10.95% ± 2.09%, 17.61% ± 1.51%, 26.60% ± 1.89% vs 2.92% ± 0.93%, P < 0.01) after 5-Aza-CdR treatment in comparison with those in the control group. The level of RUNX3 mRNA expression and the apoptotic rates of Lovo cells were increased in correlation with 5-Aza-CdR concentration (F = 168.4, F = 145.7, P < 0.01). Methylation of RUNX3 promoter region was confirmed in Lovo cells of control group and detected partly in 5-Aza-CdR-treated group.

CONCLUSION: 5-Aza-CdR is able to reverse the methylation status of RUNX3 promoter region. The re-expression of RUNX3 gene can inhibit Lovo cell growth and partly induce Lovo cell apoptosis.

Key Words: RUNX3 gene; Methylation; 5-aza-2'-deoxycytidine; Tetrazolium salt colorimetric assay; Flow cytometry; Polymerase chain reaction

0 引言

结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一, 其发生、发展与多种因素相关, 抑癌基因失活是关键因素之一. 目前研究表明, 抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等[1-4]. RUNX3是一种新发现的抑癌基因, 研究证实在胃癌组织细胞其表达明显下调, 启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的方式[4-5]. 结肠癌中该基因的表达研究尚少. 我们采用5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对肠癌细胞株进行处理, 检测RUNX3基因表达及其甲基化状态, 并分析肿瘤细胞的生物学行为改变, 以探讨肠癌的发生机制并寻求新的治疗靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

小牛血清, RPMI 1640培养基(Gibco公司), 5-Aza-CdR, MTT, DMSO, RNA酶A(RNase A)及碘化嘧啶(PI)(Sigma公司), RT-PCR试剂盒(大连宝生物公司), CpGenome^TM DNA修饰试剂盒(Intergen公司), TRIzol(MRC公司). 目的基因RUNX3及内参照GAPDH的引物均由Primer5.0软件自行设计, 引物序列如下: RUNX3上游引物: 5'-CAGCCAAATCTTGCGACTC-3', 下游引物: 5'-ACCAGAAGGACTGCCTAACC-3', 产物片段长度852 bp; GAPDH上游引物: 5'-CCATGTTCGT CATGGGTGTGAACCA-3', 下游引物: 5'-GCCAGTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3', 产物片段长度251 bp; MSP引物序列参照文献[4], 均由上海生工公司合成, 人结肠癌细胞株Lovo为华中科技大学同济医学院附属协和医院惠赠．

1.2 方法

将细胞以适宜密度接种, 加入含5-Aza-CdR的RPMI 1640培养基, 使其药物终浓度分别为0.4, 4, 40 μmol/L, 每24 h更换为新鲜药液, 浓度同前, 连续作用3 d后弃去药液, 以含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基继续培养5 d. 以未经药物干预的Lovo细胞作为对照组.

1.2.1 药物作用前后Lovo细胞增殖活性: 上述经药物处理后的细胞及对照组细胞, 以每孔3×10³个细胞接种于96孔板, 各组设5个复孔, 共接种6板. 待细胞6 h贴壁后, 及其后每隔24 h取出1板, 每孔加入5 g/L的MTT 20 μL, 置培养箱内孵育4 h后, 小心吸去培养液, 加入DMSO 150 μL, 37 ℃恒温水平摇床振摇15 min, 待晶体充分溶解后, 置全自动酶标仪于570 nm波长处读取吸光度(A), 上述实验均重复3次. 细胞增殖能力以平均吸光度(A)值分析, 以A值为纵坐标, 时间(d)为横坐标, 绘制生长曲线.

1.2.2 用药后RUNX3 mRNA的表达: 上述经药物处理后的细胞及对照组细胞, 按TRIzol试剂说明书一步法提取总RNA. 通过分光光度计检测RNA的260 nm与280 nm吸光度, 计算出RNA浓度. RNA 1 μg加入逆转录反应体系, 以随机引物Random 9 mers为引物进行逆转录反应, 逆转录反应条件参照试剂盒说明. 取逆转录反应产物2 μg, 按试剂盒说明书比例配成25 μL的PCR反应体系. PCR反应条件: 94 ℃预变性4 min, 1个循环; 94 ℃变性45 s, 57 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 共35个循环; 再以72 ℃延伸7 min. 扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成像系统进行半定量分析, RUNX3的相对表达水平 = RUNX3基因的RT-PCR产物电泳条带的密度/GAPDH基因的RT-PCR产物电泳条带的密度.

1.2.3 MSP分析RUNX3甲基化状态: 上述经药物处理后的细胞及对照组细胞, 用酚-氯仿法提取细胞的DNA. 以分光光度计测定DNA的浓度(260 nm), 260/280 nm的光密度比值应在1.8以上. 按CpGenome^TM DNA修饰试剂盒说明书, 对DNA进行亚硫酸氢盐修饰处理. 取2 μg经亚硫酸氢盐修饰的DNA, 分别加入甲基化及非甲基化特异性引物, 配成PCR反应体系25 μL. PCR反应条件: 95 ℃预变性3 min, 1个循环; 95 ℃变性30 s, 62 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共40个循环; 再以72 ℃延伸5 min. 扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成像系统观察结果.

1.2.4 细胞凋亡的检测: 上述经药物处理后的细胞及对照组细胞均以每孔2×10⁵个接种于六孔板上, 以含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基培养4 d. 按常规方法消化收集细胞, 以PBS洗涤2次, 以-20 ℃预冷的800 g/L乙醇固定, 充分振摇均匀, 置-20 ℃冰箱保存24 h以上. 检测前离心(1500 r/min, 10 min), 弃乙醇, 以PBS洗涤2次, 以PBS调节细胞密度至1×10⁹/L, 洗涤后加入由50 mmol/L磷酸钠和25 mmol/L枸橼酸按体积比9:1组成的PC缓冲液(pH7.8)50 μL, 室温放置15 min, 加PBS 0.5 mL, 100 mg/L PI 50 μL和5 mg/L RNaseA 10 μL于室温、暗处放置染色30 min, 以流式细胞仪(BD公司)进行细胞凋亡率检测.

统计学处理 实验数据用mean±SD表示, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 两组均数比较采用t检验, 所有数据均由SPSS12.0统计软件进行处理, P<0.05为统计学上差异有显著性.

2 结果

2.1 Lovo细胞形态及生长速度

光镜下观察结肠癌细胞Lovo, 于5-Aza-CdR处理前为多角形, 形态不规则; 药物处理3 d后, 可见细胞皱缩, 多角形形态趋于规则. 继续培养5 d后, 可见细胞密度低, 部分细胞体积缩小, 死亡细胞数多. 细胞经3种不同浓度5-Aza-CdR处理后, 细胞的生长速度受到不同程度的抑制, 随着药物浓度的增加抑制作用增强(图1).

图1 Lovo细胞经5-Aza-CdR处理后的生长曲线.

2.2 Lovo细胞RUNX3 mRNA的表达

RT-PCR检测对照组细胞未见RUNX3基因的mRNA表达, 5-Aza-CdR处理后的细胞RUNX3基因的mRNA重新表达(图2), 分别用浓度0.4, 4, 40 μmol/L的 5-Aza-CdR处理细胞后, 细胞RUNX3 mRNA的相对表达量分别为0.46±0.06, 0.71±0.06和0.84±0.07, 且具有剂量依赖关系(n = 3, F = 168.4, P<0.01).

图2 5-Aza-CdR处理Lovo细胞后RUNX3 mRNA的表达. 1: marker; 2: 对照组; 3-5: 0.4, 4, 40 μmol/L 5-Aza-CdR.

2.3 Lovo细胞RUNX3的甲基化状态

MSP检测对照组细胞RUNX3基因处于完全甲基化状态, 经5-Aza-CdR处理细胞后, RUNX3基因转化为部分甲基化(图3).

图3 5-Aza-CdR处理Lovo细胞前后RUNX3甲基化状态. 1: marker; 2: 对照组; 3-5: 0.4, 4, 40 μmol/L 5-Aza-CdR; U: 未甲基化; M: 甲基化.

2.4 5-Aza-CdR对Lovo细胞凋亡率的影响

经流式细胞仪检测分析, 对照组细胞凋亡率为2.92%±0.93%, 经5-Aza-CdR 0.4, 4, 40 μmol/L处理后在细胞周期G1峰前出现明显的凋亡峰, 细胞凋亡率逐渐增高, 凋亡率分别为10.95%±2.09%, 17.61%±1.51%和26.60%±1.89%, 均与对照组相比较有统计学意义(P<0.01), 细胞凋亡率与5-Aza-CdR浓度水平具有剂量依赖关系(n = 4, F = 145.7, P<0.01).

3 讨论

结肠癌是我国发病率增长最快的恶性肿瘤之一, 严重地威胁着人们的健康[6]. 其发生和发展是一个多基因、多步骤的过程, 癌基因的激活和/或抑癌基因的失活是其分子学基础. 研究表明, DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖、分化、发育及基因组印迹等方面起着重要的作用, 并与肿瘤的发生发展关系密切[7-9]. DNA启动子过甲基化是引起抑癌基因失活的重要方式. DNA过甲基化并不是基因序列发生改变, 而只是部分碱基对发生甲基化修饰, 这种异常的甲基化模式是可以逆转的[10-11]. RUNX3是一种新发现的定位于1p36.1的抑癌基因, 广泛表达于消化道上皮细胞、间叶细胞、血液细胞及神经细胞等[12-14]. RUNX3是RUNT基因家族的成员之一, RUNT基因家族是由RUNX1, RUNX2, RUNX3等3个成员组成, 其编码蛋白是一组DNA结合转录因子, 在细胞的生长、发育及凋亡过程中起着重要的作用[15-18]. 许多研究发现, RUNX3-/-的胃黏膜上皮细胞的过度增生和凋亡减少与细胞对TGF-β诱导凋亡的敏感性降低有关, TGF-β作为诱导抑制增生因子其诱导凋亡的作用在RUNX3-/-的胃黏膜上皮细胞中完全失活, 结果提示, RUNX3可能是TGF-β信号传导途径的关键作用靶点[4,19]. RUNX3蛋白是TGF-β信号通路下游的一个转录因子, TGF-β信号通路对维持细胞正常生长发育起重要作用, 并可能与肿瘤发生发展密切相关[19]. 进一步研究证实, 在TGF-β信号传导过程中, TGF-β与被激活的Smad形成的复合物由胞质转入胞核内后需在RUNX3蛋白的指导下与核内特异性的靶点相结合, 并增强其结合力, 共同调节相关靶基因的转录. RUNX3表达沉默可导致TGF-β信号途径紊乱, 引起TGF-β信号失活, 进而引发细胞的凋亡障碍, 导致肿瘤的发生[19-22].

我们发现, 结肠癌细胞株Lovo的RUNX3基因启动子区域完全甲基化, 不表达其mRNA, 而经过5-Aza-CdR处理后的细胞RUNX3基因部分甲基化, 并重新表达其mRNA, 提示在结肠癌细胞中RUNX3表达失活可能是由于启动子区域的CpG岛过甲基化所致. Oshimo et al[23]在对胃癌的研究中也有类似发现, 进一步证实RUNX3启动子区域的CpG岛过甲基化与胃肠肿瘤的发生密切相关.

5-Aza-CdR是一种DNA甲基转移酶1(DNMT1)抑制剂, 他是一种脱氧胞苷类似物, 在DNA复制过程中与DNA分子相结合, 并与DNMT1形成一共价复合物, 抑制该酶的甲基转移活性, 生成低甲基化子链, 从而实现去甲基化功能[24-27]. 我们发现, Lovo细胞经过5-Aza-CdR处理后, 细胞的增殖受到抑制, 细胞凋亡率明显提高. 上述结果显示, 5-Aza-CdR能使因甲基化失活的RUNX3基因去甲基化而重新表达, 恢复其抑癌功能, 从而导致抑制结肠癌细胞生长并诱导其凋亡的作用. RUNX3 mRNA重新表达后, 随着mRNA表达增强, 结肠癌细胞生长明显减慢, 提示RUNX3可能直接或间接参与调控细胞DNA的复制合成.

RUNX3作为一种新发现的抑癌基因, 其表达可通过TGF-β信号途径抑制细胞的过度增殖并诱导凋亡. RUNX3可能成为结肠癌的一个新的生物学标志和基因治疗的靶点, 为结肠癌的诊断和治疗提供一条新的途径. 我们仅考察了RUNX3在体外结肠癌细胞株中的表达情况, 而RUNX3在体内结肠癌及癌旁组织中的表达情况有待进一步研究.

评论

背景资料

抑癌基因启动过甲基化现象普遍存在于恶性肿瘤中. RUNX3是一种新发现的抑癌基因, RUNX3与胃癌的发生关系密切, 其启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式. 结肠癌与胃癌组织具有同源性, 因此推测RUNX3与结肠癌的发生有一定相关性.

同行评议者

沈琳, 副教授, 北京大学肿瘤医院消化内科

创新盘点

本文初步探讨了RUNX3在结肠癌细胞Lovo中的表达情况, 发现其启动子区域过甲基化可能是导致其失活的机制.

应用要点

RUNX3可能成为一个结肠癌的生物学标志和肿瘤基因治疗的靶点, 为结肠癌的诊断和治疗提供了一条新途径.

名词解释

RUNX3: 是一种新发现的定位于1p36.1的抑癌基因, 他是RUNT基因家族成员之一. 其编码蛋白是一种DNA结合转录因子, 在细胞的生长、发育及凋亡过程中起着重要的作用.

同行评价

本文讨论RUNX3基因的表达与结肠癌的关系, 该方面的研究较少, 此论文有新意.

备注

编辑: 潘伯荣 电编: 何基才

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