基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2008-09-28; 16(27): 3026-3030
在线出版日期: 2008-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i27.3026
益气清热方及其拆方的兔含药血清对Ⅰ型幽门螺杆菌致GES-1细胞凋亡的影响
陆为民, 沈洪, 严士海, 杨学文, 朱萱萱, 缪界平, 单兆伟
陆为民, 沈洪, 单兆伟, 江苏省中医院消化科 江苏省南京市 210029
严士海, 朱萱萱, 江苏省中医院药理研究室 江苏省南京市 210029
杨学文, 缪界平, 江苏省中医院检验科 江苏省南京市 210029
陆为民, 2001年南京中医药大学中医内科学博士, 硕士生导师, 2000-06赴日本九州大学研修, 主要从事中医药治疗消化系统疾病的临床及科研工作.
基金项目: 江苏省中医管理局课题资助项目, No. 200304.
作者贡献分布: 此课题由陆为民, 沈洪及单兆伟设计; 研究过程由陆为民, 严士海, 杨学文, 朱萱萱及缪界平操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由杨学文与朱萱萱提供; 数据分析由陆为民与严士海完成; 本论文写作由陆为民, 沈洪及严士海完成.
通讯作者: 陆为民, 210029, 江苏省南京市汉中路155号, 江苏省中医院消化科. wmlu@163.com
电话: 025-86618941 传真: 025-86618941
收稿日期: 2008-07-13
修回日期: 2008-08-22
接受日期: 2008-08-26
在线出版日期: 2008-09-28

目的: 观察益气清热方及其拆方对Ⅰ型H pylori致GES-1细胞凋亡的影响, 探讨益气清热法治疗H pylori感染的机制.

方法: 按生理盐水、阿莫西林、益气清热方、黄芪、黄芩分组, 制备兔含药血清. 建立Ⅰ型H pylori致GES-1细胞病变的模型, 分别加入100 mL/L各组兔含药血清的完全培养液, 继续培养48 h, 收集与固定细胞, 用流式细胞仪和Hoechst33258荧光染料检测细胞凋亡情况.

结果: 经Ⅰ型H pylori感染后, GES-1细胞凋亡率显著增加, 阿莫西林、黄芪、黄芩及益气清热方均能降低其凋亡率(1.3633±0.4229, 2.1925±0.6779, 1.7967±0.6987, 1.4740±0.4156 vs 16.6229±8.5087, P<0.01或0.05), Hoechst33258荧光染料的检测结果与流式细胞仪检测结果有较好的一致性.

结论: 益气清热方可能通过抑制细胞的凋亡, 减轻H pylori对胃上皮细胞的损伤, 维持细胞的正常生长, 达到治疗目的.

关键词: 益气清热方; Ⅰ型幽门螺杆菌; 人胃上皮细胞系GES-1; 中药; 血清药理学; 细胞培养; 细胞凋亡
引文著录: 陆为民, 沈洪, 严士海, 杨学文, 朱萱萱, 缪界平, 单兆伟. 益气清热方及其拆方的兔含药血清对Ⅰ型幽门螺杆菌致GES-1细胞凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2008; 16(27): 3026-3030
Effects of rabbit serum containing Yiqi Qingre Formula and its decomposed recipes on type I Helicobacter pylori-induced apoptosis of GES-1 cells in vitro
Wei-Min Lu, Hong Shen, Shi-Hai Yan, Xue-Wen Yang, Xuan-Xuan Zhu, Jie-Ping Miao, Zhao-Wei Shan
Wei-Min Lu, Hong Shen, Zhao-Wei Shan, Department of Gastroenterology, Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Shi-Hai Yan, Xuan-Xuan Zhu, Department of Pharmacology, Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Xue-Wen Yang, Jie-Ping Miao, Department of Laboratory, Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Supported by: Jiangsu Province Administration of Traditional Chinese Medicine, No. 200304.
Correspondence to: Wei-Min Lu, Department of Gastroenterology, Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, 155 Hanzhong Road, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China. wmlu@163.com
Received: July 13, 2008
Revised: August 22, 2008
Accepted: August 26, 2008
Published online: September 28, 2008

AIM: To observe the effects of rabbit serum containing Qi-replenishing heat-clearing formula (Yiqi Qingre Formula) and its decomposed recipes on type ⅠHelicobacter pylori (H pylori) -induced GES-1 cell apoptosis and to explore its mechanism.

METHODS: Rabbit sera saline, containing amoxicillin, Yiqi Qingre Formula, Huangqi or Huangqin were prepared. The model of type Ⅰ H pylori-induced GES-1 cell injury was established and co-cultured with the individually complete culture fluid of 100 mL/L rabbit serum for 48 h. Then, cells were collected and fixed, followed by identification of apoptosis using flow cytometry and Hoechst33258 fluorescent staining.

RESULTS: Apoptosis rate of type ⅠH pylori-infected GES-1 cells remarkedly increased in the saline group, while it was decreased either by amoxicillin, Yiqi Qingre Formula, Huangqi or Huangqin (1.3633 ± 0.4229, 2.1925 ± 0.6779, 1.7967 ± 0.6987, 1.4740 ± 0.4156 vs 16.6229 ± 8.5087, P < 0.01 or 0.05). The coincidence rate determined using flow cytometry and Hoechst33258 fluorescent staining was high.

CONCLUSION: Yiqi Qingre Formula has the effects of alleviating type ⅠH pylori-induced gastric epithelial cell injury through inhibition of cell apoptosis, thus maintaining cell growth.

Key Words: Yiqi Qingre Formula; Type I Helicobacter pylori; Human gastric epithelial cell line GES-1; Chinese herb; Serum pharmacology; Cell culture; Cell apoptosis
0 引言

我国属幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H pylori)高感染国家, 普通人群中的感染率在30%-80%左右, 但H pylori感染人群中只有少数人表现出不同程度的症状. 因此, H pylori菌株间毒力的不同及胃黏膜防御功能的强弱可能是H pylori感染者是否发病或发生何种疾病的重要原因[1-5]. 本研究通过观察Ⅰ型H pylori对人胃上皮细胞凋亡的影响, 探讨益气清热法治疗H pylori感染的机制.

1 材料和方法
1.1 材料

炙黄芪、黄芩、炒白术、仙鹤草等颗粒购自江阴天江药业有限公司; 阿莫西林胶囊: 哈药集团制药总厂(A05080994); DMEM: Gibco (1255136); HEPES: 江苏科威技术服务有限公司(H3375); 碳酸氢钠: 上海虹光化工厂(010916); 青霉素: 山东鲁抗医药股份有限公司(B040213); 链霉素: 大连美罗大药厂(040707); 胎牛血清: 北京元享圣马生物研究所(050321); 胰蛋白酶: 上海伯奥生物技术有限公司(050401). 人胃黏膜上皮细胞(GES-1)购自北京市肿瘤研究所. 新西兰大白兔, ♂, 购自南京青龙山动物饲养厂.

1.2 方法

1.2.1 H pylori菌株及培养: 选择标准的Ⅰ型H pylori菌株ATCC49503. 将H pylori菌株接种于含70 mL/L马血清的琼脂培养板上, 置于37 ℃微需氧环境中(50 mL/L O2, 100 mL/L CO2, 850 mL/L N2)培养, 48 h收集细菌, 用含100 mL/L胎牛血清的无抗生素RPMI 1640培养液制成细菌悬液, 浓度为1011 cfu/L, 备用.

1.2.2 分组及给药: 取♂大白兔15只, 体质量在2.0-2.6 kg之间, 随机分成5组, 每组3只. 按体质量表面积折算动物的等效剂量, 阿莫西林组: 0.125 g/kg; 益气清热方组: 10 g/kg; 黄芪组: 1.25 g/kg; 黄芩组: 0.83 g/kg, 配成溶液, 按2 mL/kg每天ig; 生理盐水组: 生理盐水2 mL/kg, 每天ig. 连续3 d, 最后1 d连续2次ig, 中间间隔2 h, 末次给药3 h后, 耳缘静脉采血, 放置1 h, 离心(2500 r/min, 30 min). 抽取血清, 56 ℃, 30 min灭活, 经0.22 μm滤膜抽滤除菌, 分装, -20 ℃保存备用.

1.2.3 GES-1细胞的培养与传代: GES-1培养方法见文献[6]. 当GES-1细胞长成单层后, 弃去旧培养液, 用PBS冲洗2次. 加入适量1 g/L胰酶消化5 min, 当镜下细胞间出现较多缝隙时, 倒掉胰酶, 加入完全培养基, 吹打成单个细胞悬液, 记数细胞约107个/L, 按1:2传代.

1.2.4 H pylori致GES-1细胞病变模型的建立: 用2.5 g/L胰蛋白酶消化已长成单层的GES-1细胞, 用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养液配成细胞悬液, 以每瓶约105个细胞接入10 mL小培养瓶内, 每瓶1 mL. 将培养瓶移入CO2培养箱内, 在37 ℃, 50 mL/L CO2及饱和湿度下, 培养48 h. 细胞长至瓶底大约60%-70%. 用不含双抗的100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养液, 把H pylori(初始浓度为a: 1011 cfu/L)稀释为a/16, a/32, a/64. 根据实验结果, 确定a/32浓度(即3.125×109 cfu/L)的H pylori菌液与GES-1细胞共培养6 h为最佳的病变模型.

1.2.5 分组处理: 在GES-1细胞培养瓶内先加入3.125×109 cfu/L H pylori菌液1 mL, 培养6 h, 去培养液, 按生理盐水组、阿莫西林组、益气清热方组、黄芪组、黄芩组再分别加入含100 mL/L各组兔血清的完全培养液, 继续培养48 h.

1.2.6 细胞收集与固定: 取培养瓶, 去培养液, 加入消化液(2.5 g/L胰蛋白酶+0.4 g/L EDTA), 消化1-2 min. 去消化液, 加入PBS, 清洗2次. 加入预冷的700 mL/L乙醇, 吹打均匀, 置-20 ℃冰箱内, 过夜.

1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率: 固定后的细胞用PBS洗涤2次, 并将每个待测样本的细胞总数调至106个, 加入PC缓冲液50 μL, 室温放置30 min, PBS洗涤2次, 再加入PI溶液100 μL和5 mg/L的RNAase 10 μL, 室温下避光染色30 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡率.

1.2.8 Hoechst33258荧光染料检测细胞凋亡: 弃去培养液, 向培养板中加入固定液(冰醋酸与甲醇以1:3的比例混合而成), 固定细胞10 min, 加入0.5 mg/L的Hoechst33258荧光染料, 室温下避光染色1 h, 荧光显微镜下观察凋亡细胞核的形态, 并记数凋亡细胞个数, 每张玻片至少记数1000个细胞, 细胞凋亡率用凋亡细胞数占细胞总数的百分比表示.

统计学处理 实验数据用mean±SD表示, 利用SPSS13.0软件进行统计学分析. 多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 若P<0.05, 两者有显著性差异; P<0.01, 两者有极显著性差异.

2 结果

流式细胞仪检测, 经H pylori感染后, GES-1细胞凋亡率显著增加, 阿莫西林、黄芪、黄芩及益气清热方均能降低其凋亡率(表1, 图1). Hoechst33258荧光染料检测, 经H pylori感染后, GES-1细胞凋亡率显著增加, 阿莫西林、黄芪、黄芩及益气清热方均能降低其凋亡率, 与流式细胞仪检测结果有较好的一致性(表1). 生理盐水组核固缩明显, 益气清热方组、黄芪组能明显改善细胞凋亡现象, 黄芩组效果较差(图2).

表1 黄芪、黄芩与益气清热方的含药血清对H pylori致GES-1细胞凋亡的影响 (mean±SD, %).
分组流式细胞仪检测Hoechst33258荧光染料检测
正常组1.9600±0.799290.6780±0.3113
生理盐水组16.6229±8.5087b12.8825±3.3005b
阿莫西林组1.3633±0.4229d2.6487±0.9596d
益气清热方组2.1925±0.6779d2.4868±0.9075d
黄芪组1.7967±0.6987d2.8765±0.9972d
黄芩组1.4740±0.4156d5.8775±1.2626c
bP<0.01 vs 正常组;
cP<0.05,
dP<0.01 vs 生理盐水组.
图1
图1 流式细胞仪检测GES-1细胞凋亡图. A: 正常组; B: 生理盐水组; C: 阿莫西林组; D: 益气清热方组; E: 黄芪组; F: 黄芩组.
图2
图2 Hoechst33258荧光染料检测细胞凋亡图(×400). A: 正常组; B: 生理盐水组; C: 阿莫西林组; D: 益气清热方组; E: 黄芪组; F: 黄芩组.
3 讨论

1994年WHO明确将H pylori定为Ⅰ类致癌因子[7], 根据Correa勾画的肠型胃癌自然史, H pylori相关性胃炎的大量出现, 无疑会增加慢性萎缩性胃炎(CAG)、肠上皮化生、异型增生及胃癌的发生率[8], 但不同菌株的H pylori感染可导致不同的结局. 研究表明, 不同H pylori菌株的形态、结构、生理或生化特性都很相似, 传统的微生物试验也不能区分彼此, 但在分子水平上存在显著差异, 根据H pylori是否同时表达细胞毒相关蛋白(CagA)和空泡毒素蛋白(VacA)两种毒力因子, 可将H pylori分为两型:Ⅰ型, 即高毒力株H pylori, 具有cagA基因, 表达CagA蛋白和VacA蛋白; Ⅱ型, 即低毒力株H pylori, 不具有cagA, 不产生CagA蛋白和VacA蛋白[9-10]. 有证据表明Ⅰ型H pylori感染导致的炎症反应更为明显, 细胞凋亡与增殖失衡, 更能加重胃黏膜上皮细胞损伤, 促进抑癌基因的失活及癌基因的激活, 与CAG、胃癌等的关系更为密切[11-15].

细胞凋亡异常与包括肿瘤在内的一系列胃肠疾病的发生有关. 近年来研究发现, H pylori可导致患者的胃黏膜及培养的胃上皮细胞凋亡增加[16-23], 在根除H pylori感染成功的患者, 细胞凋亡指数可恢复正常[24-25]. 胃上皮细胞凋亡增加将打破细胞增殖与细胞丢失之间的平衡, 使胃黏膜细胞的数量不断减少, 可能导致胃黏膜萎缩或溃疡形成. 但是, 也有报道显示,凋亡细胞增加的同时, 增殖细胞的数量也增加[26-27], 尽管细胞增殖可能是维持组织完整性的重要的生理反应, 但只要增殖存在, 就有可能使新产生的细胞发生某种基因变异, 最终也可导致组织的异型增生, 甚至肿瘤的形成.

H pylori在体外诱导胃上皮细胞凋亡的研究, 国内外已有不少报道[19-23,28-30], 而运用中药血清药理学及细胞培养方法开展中药复方对Ⅰ型H pylori致胃上皮细胞凋亡影响的研究则是缺如. 为此, 本研究以GES-1细胞作为H pylori感染的体外细胞模型, 观察了益气清热方及其拆方的兔含药血清对Ⅰ型H pylori致GES-1细胞凋亡的影响, 同时用流式细胞术、荧光染色技术检测了细胞凋亡率. 结果显示, 经Ⅰ型H pylori感染后, GES-1细胞凋亡率显著增加, 阿莫西林、黄芪、黄芩及益气清热方的兔含药血清均能降低其凋亡率, 提示益气清热中药可能通过降低过高的细胞凋亡率, 维持细胞正常的生长过程, 减轻H pylori对胃上皮细胞的损害作用, 而达到治疗作用. 既往的临床研究显示, 经益气清热法治疗后, 患者的临床症状、胃镜及组织病理学检查均有显著改善, 甚至康复[31], 提示中医药治疗H pylori感染的机制不能局限在单纯的抑杀作用, 可能关键在于减轻和削弱其毒力, 使其致病性下降, 甚或转化为无毒的H pylori, 有关这方面的机制值得进一步探讨.

评论
背景资料

我国属H pylori高感染国家, 但仅少数人有不同程度的症状. H pylori可分为高毒力株(Ⅰ型)和低毒力株(Ⅱ型), 菌株间毒力的不同及胃黏膜防御功能的强弱可能是H pylori感染者是否发病或发生何种疾病的重要原因. 多年来, 中医药进行的研究注重在H pylori转阴或根除方面, 其根除率虽远较西药低, 但患者的临床症状及组织病理学均有显著改善, 甚至康复, 提示中医药治疗H pylori感染的机制不能局限于单纯的抑杀作用.

同行评议者

张声生, 教授, 首都医科大学附属北京中医医院消化中心

研发前沿

体外抑菌试验表明中药有较好的抗H pylori作用, 但无法从本质上阐释其机制, 借助细胞模型进行研究成为目前的热点.

相关报道

Maeda et al开展了H pylori对胃上皮细胞凋亡影响的研究, 多数结果显示H pylori可致胃上皮细胞凋亡的增加.

创新盘点

运用中药血清药理学及细胞培养技术, 开展中药复方及其拆方的兔含药血清对Ⅰ型H pylori致GES-1细胞凋亡的研究.

应用要点

本研究为进一步阐明中医药治疗H pylori感染的机制提供了有意义的线索.

同行评价

本文观察益气清热方及其拆方的兔含药血清对Ⅰ型H pylori致GES-1细胞凋亡的影响, 数据可靠, 结论可信, 具有一定的学术价值.

编辑: 李军亮 电编: 何基才

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