RNAi抑制结肠癌细胞系DcR3的表达及对癌细胞生长的影响

摘要

目的: 观察抑制DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞其恶性表型的改变.

方法: 应用RNA干扰(RNAi)技术, 构建小双链DNA, 克隆入表达载体, 转染进入SW480结肠癌细胞系(DcR3高表达细胞), 在细胞内形成小干扰双链RNA; 识别并降解DcR3 mRNA. 筛选DcR3低表达转染癌细胞, 观测其体外DcR3-SW480-RNAi转染细胞的增长率及凋亡表达.

结果: 与对照组相比, 转染DcR3-RNAi(F1R1)的WS480细胞, DcR3 mRNA的表达明显降低, 各组相比, 加入DcR3-RNAi(F1R1)组的SW480细胞数量明显减少, 而仅加入DcR3及对照组细胞数量明显增加. 统计学处理差异显著(P<0.001). 与对照组相比, 经DcR3-RNAi处理组凋亡抗体Caspase3及PARP产物表达增加.

结论: 经转染的DcR3-RNAi-SW480结肠癌细胞其DcR3 mRNA表达降低. 肿瘤细胞的生长数量减少, 凋亡增加, 有一定可探索性抗癌前景.

关键词: DcR3; RNA干扰技术; SW480结肠癌细胞系

Depressed DcR3 expression induced by RNA interference and its effect on growth of colonic cancer cells

Lu-Ping Wang, Shan-Ming Yang, Xue-Ming Xu, Jian Chen, Guang-Zhi Yang, Lu-Rong Zhang

Lu-Ping Wang, Jian Chen, Guang-Zhi Yang, Department of Pathology, General Hospital of Chinese PLA Beijing Military Area, Beijing 100700, China

Shan-Ming Yang, Xue-Ming Xu, Lu-Rong Zhang, Department of Oncology, Lombardi Cancer Center, Gerogetown University, 20007 Washington DC, United States

Supported by: National Naturel Science Foundation, No. 30340064.

Correspondence to: Lu-Ping Wang, Department of Pathology, General Hospital of Chinese PLA Beijing Military Area, Beijing 100700, China. bzwlp@yahoo.com

Received: November 29, 2007
Revised: July 2, 2008
Accepted: July 10, 2008
Published online: July 18, 2008

Abstract

AIM: To study relationship between depressed DcR3 gene expression and changes of malignant phenotype on SW480 colonic carcinima cells line.

METHODS: Using RNAi method, we constructed a small interfering double-strand DcR3-RNA, then cloned it into vector "pSilencer 2.1 Hygro", and finally transfected the vector into SW480 colonic cancer cells expressing a high level of DcR3. The small double-strand RNA was recognized and the DcR3 mRNA was reduced. The DcR3 low-expression cancer cells were screened and their growth and apoptosis were measured.

RESULTS: In comparison with that in the control group, the expression of DcR3 mRNA was down-regulated remarkably in the cells transfected with DcR3-RNAi (F1R1). Group comparison results showed that the quantity of SW480 cells was markedly decreased in the DcR3-RNAi (F1R1)-transfected group than that in the DcR3 group or control group (P < 0.001). The expression levels of Caspase3 and PARP product were increased in the DcR3-RNAi-transfected group as compared with those in the control group.

CONCLUSION: DcR3-RNAi down-regulates the expression of DcR3 mRNA in SW480 colonic carcinoma cells, which leads to inhibition of cell growth and enhancement of cell apoptosis.

Key Words: DcR3; RNA interference; SW480 colonic cells line

0 引言

DcR3(又称TR6)属肿瘤坏死因子受体家族, 被认为是阻断细胞凋亡, 保护肿瘤细胞生长的新基因[1-3]. 一些恶性肿瘤中DcR3 mRNA表达明显升高[4-8]. 我们的前期研究发现通过阻断外源性及内源性FasL, DcR3可保护乳癌细胞生长; 伴有淋巴结转移的癌DcR3表达明显增高[14]. 在上述研究的基础上, 我们应用RNA干扰(RNAi)技术, 阻断DcR3基因表达, 探讨阻断DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞是否降低其恶性表型, 是否有治疗肿瘤的前景.

1 材料和方法

1.1 材料

pSilencer 2.1-U6nHygro-DcR3-dsDNA 质粒(含沉默DcR3基因片段)由王鲁平医师在美国Gerogetown1大学Lombardi癌症研究中心构建, 并经测序与GenBank中的序列一致. Silencer siRNA Cocktail试剂盒购自美国Ambion公司; 胎牛血清、DMEM细胞培养夜和G418购自Gibco公司; TRIzol试剂购自Life Technologies公司; RT-PCR试剂盒购自Promega公司; 鼠抗DcR3一抗由Sunghee Kim和张鲁榕教授惠赠; Caspase 3和PARP一抗购自Dako公司; BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce, Rockford IL公司; Western印记化学发光物购自Amersham公司. 结肠癌细胞系SW480来自美国Gerogetown大学Lombardi癌症研究中心细胞库; 培养基为含有100 mL/L胎牛血清的DMEM细胞培养夜. 转染后的SW480细胞培养条件为在上述培养基中加入G418(800 mg/L).

1.2 方法

1.2.1 DcR3-RNA基因克隆, 质粒构建及SW480细胞转染、鉴定、筛选: 使用"Silencer siRNA Cocktail试剂盒"选择2个siRNA靶位点, 靶位点1(F1R1)核苷酸95-123, 靶位点2(F2R2)核苷酸247-265. 使用online BLAST软件与GenBank中其他基因进行比较, 排除所选择靶序列与其他基因有显著性同源. F1R1 ACACCCACCTACCCCTGGC(95-123), F2R2 CTACCTGGAGCGCTGCCGC(247-265). 每一个包括正义和反义靶序列, 中间以9个核苷酸的环状区, 末端有一RNA多聚酶Ⅲ的中止信号序列. 其正向、反向两链被合成, 以形成一个双链DNA, 其末端有BamHⅠ和HindⅢ位点. 经基因测序证实片段序列无误. 将双链DNA分别克隆进入载体, 具体步骤: F1R1和F2R2双链DNA, pSilencer 2.1-U6nHygro各2-3 g/L, 加入50 μL conpenent细胞(大肠杆菌), 4℃ 30 min, 42℃ 15 s, 放置冰上1-2 min, 加入9倍体积SOC, 37℃震荡1 h, 铺于Agarose+LB培养板上, 震荡37℃过夜. 次日挑选1个克隆加入100 mL LB及卡那霉素30 mg/L, 震荡37℃过夜. 将上清弃之, 应用试剂盒纯化沉淀物中DNA, 琼脂糖凝胶电泳检测纯化物. 限制性内切酶切上述质粒, (BamHⅠ+HindⅢ), 纯化酶切产物. 连接酶连接载体及DcR3-DNA片段. 碱裂解法大量提取纯化该质粒DNA. A测量DNA浓度. pSilencer 2.1-U6nHygro-DcR3-dsDNA稳定转染进入SW480结肠癌细胞系. 转染前16-20 h用胰酶消化对数生长期细胞, 将细胞移置100 mm培养皿中, 细胞数1×106在100 mL/L的胎牛血清DMEM中. 转染前4 h, 再次换培养液. 配置转染液: 依次加入H₂O, DNA, CaCl₂, 及2×BBS, 缓慢小心混合, 静置45 min, 缓慢加入细胞内, 30 mL/L CO₂孵育箱中培养. 第3天加入G418(800 mg/L FBS-DMEM), 培养筛选. 挑选可在G418环境下生长的转染SW480细胞集落, 行RT-PCR分析: 应用TRIzol试剂提取转染后SW480细胞的RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物. 应用RT-PCR试剂盒反转录、扩增检测其cDNA含量. 从人DcR3基因序列中选择合成两段引物: F1正义: 5-CCTGGCGGGACGAGACA-3, R1反义: 5-TGGCACTGCGAGTTCTGGCT-3; F2正义: 5-TGCCAGGCTCTTCCTCCCAT-3, R2反义 5-TCACGGACGCTCCGCTCCAG-3; 经RT-PCR后, 不同组DNA经琼脂糖电泳检测, 紫外光下显示并摄影.

1.2.2 DcR3-SW480-RNAi转染细胞: 检测DcR3-SW480-RNAi转染细胞对体外肿瘤细胞生长的作用. 1.5-2×10⁴/孔SW480细胞系培养于96孔板, 分为不同组分加入不同物质48 h后, 加入3H TdR(0、3 mCi/well)过夜. EDTA消化液收获细胞. 应用β-counter计算3H TdR掺入结合率. 统计学处理比较各组细胞的掺入结合率.

1.2.3 Western印记检测凋亡活性: 应用细胞裂解液对6孔板培养DcR3-SW480-RNAi培养细胞及对照组细胞进行收获. BCA蛋白检测试剂盒检测其蛋白浓度. 每孔加30 mg蛋白入SDS聚丙酰胺凝胶, 电泳之后, 4℃、50 V下湿式电转移仪将蛋白质转入PVDF膜. 50 g/L脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h, 一抗包括鼠抗人活性Caspase3, PARP(1:5000)孵育PVDF膜4℃过夜, PBS-T充分洗涤, HRP-抗鼠二抗(1:10 000)1 h, PBS-T充分洗涤后化学发光底物孵育1 min, 暗室中将膜贴于增色胶片暴光、显影、洗相. 直至出现条带.

统计学处理 应用SPSS12.0统计学软件进行资料处理, 定量结果以mean±SD表示, 应用t检验分析, P<0.05具有统计学意义.

2 结果

2.1 转染后的DcR3-RNAi-SW480细胞中DcR3 mRNA的表达

应用RT-PCR观察DcR3-siRNA- SW480对DcR3 mRNA的表达(图1). 与对照组相比, 转染DcR3-RNAi(F1R1)的WS480细胞, DcR3 mRNA 的表达明显降低.

图1 应用RT-PCR观察DcR3-siRNA-SW480对DcR3 mRNA的表达. A: 转染后48 h; B: 转染后72 h. 1: marker; 2, 4: 空白质粒对照组; 3: DcR3-RNAi处理组

2.2 DcR3-RNAi-SW480细胞对体外肿瘤细胞生长的影响

3H掺入法检测经不同处理各组SW480细胞数量的变化(图2), 各组相比, 加入DcR3 RNAiF1R1组其SW480细胞数量明显减少, 而仅加入DcR3及对照组细胞数量明显增加. 统计学处理差异显著(P<0.001).

图2 DcR3-RNAi对SW480细胞生长的影响. 1: 空白质粒组; 2-3: 空白质粒组+转染液; 4: DcR3组; 5: DcR3组+DcR3-RNAiF2R2; 6, 8: DcR3-RNAiF1R1; 7, 9: 空白质粒+DcR3(煮沸). ^bP<0.001 vs 其他组

2.3 Western印记检测

应用活性Caspase3及PARP的免疫印记法, 与对照组相比, 经DcR3-RNAi处理组的活性Caspase3表达凋亡条带增强(图3A), 同样与对照组相比, 经DcR3-RNAi处理组PARP产物表达明显增强(图3B).

图3 Western印记法检测Caspase3、PARP. A: Caspase3检测; B: PARP检测; 1-2: 单纯SW480细胞; 3: DcR3SW480细胞; 4: DcR3-RNAi-SW480SW480细胞

3 讨论

DcR3基因位于染色体20q13.3, 成熟DcR3分子质量为35 kDa, cDNA编码为约1 kb核苷酸, 为分泌性、可溶性多肽[6]. 目前认为是一个具有拮抗凋亡, 促进细胞生长, 调节免疫功能的新基因, 对肿瘤的生长分化有较大影响. 研究表明DcR3发挥其重要生物学功能, 是因其可结合3个重要的凋亡配基: FasL, LIGHT, TLIA, 与其竞争死亡受体, 阻断其诱导凋亡的作用[1-2]. 研究发现, 正常人体组织中胃、脊髓、淋巴结、气管、脾、结肠和肺有低水平DcR3 mRNA表达[3-4]. 胃肠道癌、结肠癌[3]、肺癌[5]、肝癌[6]. EBV/HTLV-1阳性的淋巴瘤均伴有DcR3基因扩增或蛋白水平高表达[7]. 对146例肿瘤, 19例急性感染和29例正常健康人的血清DcR3检测结果显示, 56%、2%的肿瘤患者血清DcR3阳性, 其中98%、8%为恶性肿瘤患者, 当肿瘤被切除后, 血清DcR3浓度下降. 97%的急性感染和正常健康人(47/48)血清DcR3阴性. 22/31(71%)例胃癌患者血清DcR3阳性, 其阳性率与胃癌TNM分期有关. 提示血清DcR3的检测将成为恶性病变的有意义的诊断、治疗、预后参数[6-8]. 我们的研究结果提示DcR3在乳腺癌中的表达率为62%, 而乳腺良性病变无表达, 伴有淋巴结转移的乳腺癌DcR3表达率明显升高达80%[14]. 上述结果提示DcR3对肿瘤发生、发展起着上调作用, 恶性肿瘤显示DcR3 mRNA及蛋白水平过表达.

基于上述发现, 本研究应用RNA干扰(RNAi)技术, 阻断DcR3基因表达, 观察阻断DcR3基因表达的人SW480结肠癌细胞恶性表型的影响. 双链RNA介导的基因阻断机制是1998年发现的[9]. 他通过双链RNA的介导特异性地降解相应序列的mRNA, 从而导致转录后水平的基因沉默. 抑制基因表达的效率至少比传统反义技术高2个数量级. RNA降解过程涉及两个步骤: 双链RNA被名为Dicer的RNaseⅢ样蛋白加工成21-25 nt长度的小干扰RNA(siRNA); 反义链RNA引导核酸内切酶复合体(RISC)去除单链的同源mRNA. RISC在小干涉RNA的引导下, 切断序列特异的mRNA, mRNA进一步降解[10-11]. 已有证据表明siRNA介导的RNAi能特异性抵御病毒的入侵, 拮抗植物肿瘤发生. 同时也为抗癌治疗提供了新的基因研究策略.

我们应用双链RNAi技术特异性降解DcR3 mRNA, 从而阻断DcR3基因的表达. 首先在DcR3基因序列中选择小干扰RNA(siRNA)靶位点, 每一个包括正义和反义靶序列片段, 中间间以9个核苷酸的环状区, 末端有一RNA多聚酶Ⅲ的中止信号序列, 合成一个有环状结构的双链DNA, 其末端有BamHⅠ和HindⅢ位点. 克隆入载体pSilencer 2.1-U6 Hygro; 转染进入SW480人结肠癌细胞(DcR3高表达细胞)[12], 在细胞内形成小干扰双链RNA; 识别并降解DcR3 mRNA; 筛选DcR3 mRNA及蛋白低表达转染癌细胞, 并以空质粒转染SW480细胞作为对照, 观测其体外细胞增殖率, 各组增殖细胞的蛋白表达率, 探讨抑制DcR3基因表达的的人SW480结肠癌细胞是否可降低其生长速度及恶性表型. 结果表明, 转染的DcR3-RNAi-SW480-F1R1细胞DcR3 mRNA表达明显降低. 与对照组相比, 转染的DcR3-RNAi-F1R1 SW480肿瘤细胞数量明显减少. 肿瘤细胞中DcR3蛋白含量明显减少. 经统计学处理差异显著(P<0.05). 经DcR3-RNAi(DcR3-siRNA)处理的细胞, PARP及Caspase3的表达增强. PARP是细胞程序死亡的一个早期分子标志, Caspase被认为是凋亡的中心实施者, 细胞经多因子多途径的相互作用, Caspase活化降解其作用底物, 引起其特征性形态学生物化学改变, 完成细胞的凋亡过程. PARP作为基因组监测和DNA修复酶, 是第一个在凋亡中由Caspase3和其他系列Caspase降解的底物, 被称为细胞凋亡的死亡底物[13]. 应用DcR3-RNAi技术, 阻断了DcR3的基因表达, 使其不能与3个重要的凋亡配基Fas-l, LIGHT, TLIA结合, 由此介导肿瘤细胞产生凋亡, 肿瘤细胞的生长数量减少, 有一定可探索性抗癌基因治疗前景, 尚有待于动物体内实验的证实.

评论

背景资料

DcR3基因位于染色体20q13.3, 成熟DcR3分子质量为35 kDa, cDNA编码为约1 kb核苷酸, 为分泌性、可溶性多肽. 目前认为是一个具有拮抗凋亡, 促进细胞生长, 调节免疫功能的新基因, 对肿瘤的生长分化有较大影响.

同行评议者

姜春萌, 教授, 大连医科大学附属第二医院消化科

相关报道

本课题组前期研究发现通过阻断外源性及内源性FasL, DcR3可保护乳癌细胞生长; 伴有淋巴结转移的癌DcR3表达明显增高.

应用要点

本研究应用RNAi技术, 抑制SW480结肠癌细胞中mRNA的表达, 其结果发现DcR3 mRNA表达下降后, 人结肠癌SW480细胞数量减少, 凋亡表达增加. DcR3-RNAi技术可能有一定抗癌前景.

同行评价

本研究内容较先进, 实验设计合理, 研究方法适当, 具有重要的参考价值.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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