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世界华人消化杂志. 2008-06-28; 16(18): 2072-2075
在线出版日期: 2008-06-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i18.2072
广西地区幽门螺杆菌CagA基因表达及其耐药性
李素艳, 唐国都, 黄杰安, 朱莲娜, 覃锦耀
李素艳, 唐国都, 黄杰安, 朱莲娜, 覃锦耀, 广西医科大学第一附属医院消化内科 广西壮族自治区南宁市 530021
作者贡献分布: 李素艳与唐国都对此文所作的贡献均等; 此课题由李素艳, 唐国都及黄杰安设计; 实验过程由李素艳, 黄杰安, 朱莲娜及覃锦耀操作完成; 数据分析和论文写作由李素艳与唐国都完成.
通讯作者: 李素艳, 530021, 广西壮族自治区南宁市, 广西医科大学一附院干部门诊. lsyhao662008@sina.com
电话: 0771-5356590
收稿日期: 2008-01-22
修回日期: 2008-03-16
接受日期: 2008-05-20
在线出版日期: 2008-06-28

目的: 了解广西地区上消化道疾病患者幽门螺杆菌(H. pylori)细胞毒素相关蛋白(CagA)基因的表达情况及其对常用抗生素的敏感性, 为临床诊疗H. pylori感染提供理论依据.

方法: 从上消化道疾病患者胃黏膜中分离出50株H. pylori, 用特异性引物扩增H. pylori CagA基因到297 bp片段, 经聚合酶链反应(PCR)检测, 同时采用E-test法对这50株H. pylori进行抗生素敏感试验.

结果: 50株H. pylori中有76%(38/50)的菌株有CagA基因, 其表达在消化性溃疡患者与慢性胃炎患者以及男性与女性患者间差异无显著性. 50株H. pylori对甲硝唑的耐药率为86.0%(43/50), 克拉霉素的耐药率为6.0%(3/50), 四环素的耐药率为4.0%(2/50), 未发现对阿莫西林耐药的菌株. 甲硝唑的耐药率明显高于四环素和克拉霉素的耐药性(P<0.01). CagA阳性菌株耐药性为89.5%(34/38), CagA阴性菌株的耐药率为75.0%(9/12), 两者比较差异无显著性.

结论: 广西地区CagA阳性菌株是上消化道疾病发生的主要因素. H. pylori对阿莫西林、克拉霉素和四环素的敏感性较高, 可作为抗H. pylori的首选药物, 甲硝唑的耐药率高, 临床上治疗H. pylori感染时应尽量避免使用甲硝唑.

关键词: 幽门螺杆菌; 细胞毒素相关基因蛋白; 耐药率; 聚合酶链反应; E-test药敏试验
引文著录: 李素艳, 唐国都, 黄杰安, 朱莲娜, 覃锦耀. 广西地区幽门螺杆菌CagA基因表达及其耐药性. 世界华人消化杂志 2008; 16(18): 2072-2075
Expression of CagA gene in Helicobacter pylori among patients of Guangxi Zhuang Autonomous Region and its drug resistance
Su-Yan Li, Guo-Du Tang, Jie-An Huang, Lian-Na Zhu, Jin-Yao Qin
Su-Yan Li, Guo-Du Tang, Jie-An Huang, Lian-Na Zhu, Jin-Yao Qin, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Correspondence to: Su-Yan Li, Department of Cadre Clinic, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. lsyhao662008@sina.com
Received: January 22, 2008
Revised: March 16, 2008
Accepted: May 20, 2008
Published online: June 28, 2008

AIM: To determine the expression of CagA gene of Helicobacter pylori (H. pylori) strains and its resistance to common drugs in Guangxi Zhuang Autonomous Region, and thereby to provide a theoretical basis for clinical diagnosis and treatment.

METHODS: Fifty H. pylori strains were isolated and CagA gene of H. pylori was amplified using specific primers into 297 bp. H. pylori was determined using PCR for CagA gene and E-test was performed to estimate H. pylori's susceptibility.

RESULTS: The expression of CagA in H. pylori strains was 76.0% (38/50). There were no significant CagA gene expressional differences between peptic ulcer and chronic gastritis or between female and male. Resistance rates of H. pylori strains were as follows: 86.0% (43/50) to metronidazole, 6.0% (3/50) to clarithromycin and 4.0%(2/50) to tetracycline. There were no H. pylori strains resistant to amoxicilin. Resistance to metronidazole was significantly higher than that to other drugs (P < 0.01). The percentage of CagA-positive resistant strains was 89.5% (34/38) and that of CagA-negative resistant strains was 75% (9/12). There was no significant difference between CagA-negative and CagA-positive strains.

CONCLUSION: CagA-positive H. pylori strains are mainly responsible for gastroenteric diseases. In Guangxi Zhuang Autonomous Region, high susceptibility of H. pylori to amoxiciline, clarithromycin and tetracycline indicate that they are drugs of first choice for H. pylori eradication therapy. However, as resistance to metronidazole is high, metronidazole should be avoided where possible.

Key Words: Helicobacter pylori; Cytotoxin-associated antigen; Resistance; Polymerase chain reaction; E-test
0 引言

幽门螺杆菌(H. pylori)是慢性胃炎、消化性溃疡的重要致病因素, 是胃癌和胃黏膜相关淋巴瘤(MALT)的重要因素之一, WHO已将H. pylori列为第Ⅰ类致癌因子. H. pylori有许多致病因子, 其中鞭毛、尿素酶、细胞毒素相关蛋白(cytotoxin-associated antigen, CagA)、细胞空泡毒素(vacuolating cytotorin antigen, VacA)、热休克蛋白(heat-shock protein, HSP), 中性粒细胞活性蛋白(neutrophil-acting protein, NAP)等均与致病有关. H. pylori在人群中感染的广泛性和他的强致病性, 均使人们对他的致病机制和治疗格外关注. 由于H. pylori感染存在地域差异, 其耐药性也因地域不同而有差异. 本研究从广西籍上消化道疾病患者胃黏膜分离出50个H. pylori菌株进行CagA基因检测和耐药性测定, 探讨广西地区H. pylori的毒力状况和耐药情况, 以及两者的关系, 为临床诊断和治疗H. pylori感染提供理论依据.

1 材料和方法
1.1 材料

2004-11/2005-07在广西医科大学一附院、广西区人民医院、中国人民解放军301医院、南宁市第二人民医院和广西武警总队医院因上消化道疾病行胃镜检查的广西籍患者, 取其胃黏膜进行H. pylori分离培养, 随机抽取50个菌株, 男患者27例, 女患者23例, 年龄20-82(平均45.9±2.3)岁. 经胃镜和病理证实消化性溃疡26例, 慢性胃炎24例. H. pylori标准菌株NCTC11637CagA阳性由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠. PCR仪为美国PE Biosystems公司生产的5700型基因合成仪, 电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-Ⅲ-8B型电泳仪, 显影仪为上海生产的MODEL ZF-3型紫外光检测仪; 引物D008、引物R008、dNTP、MgCl2、10×PCR Buffer, 均购于上海生工生物工程技术服务有限公司. 空肠弯曲菌基础培养基43 g由中国腹泻病控制上海试剂供应研究中心提供, 4种常用抗生素的E-test药敏试条(Amoxiciline, AC; Clarithromycin, CH; Metronidazole, MZ; Tetracycline, TC. 浓度范围均为0.016-256 mg/L)由瑞典AB. Biodisk公司提供, 麦氏比浊仪是法国梅里埃公司生产.

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的制备: 取少许H. pylori菌落置于200 μL冻存液中制成H. pylori混悬液, 取1 mL H. pylori混悬液加入裂解液200 μL(含有蛋白酶K, 浓度200 mg/L), 经55℃水浴10 min, 煮沸10 min后, 以1×104 r/min离心5 min, 取上清液5 mL用于PCR扩增.

1.2.2 PCR检测CagA基因: PCR引物针对CagA基因保守区设计, 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成: D008 5-ATAATGCTAAATTAGA CAACTTCAGCGA-3(nt 1751-1778), R008 5-TTAGAATAATCAA-CAAACATCACGCCAT-3(nt 2021-2048), 扩增靶位片断长度为297 bp. PCR反应液体积20 mL, 内含有1 mmol D008/R008引物, 2.0 U Taq DNA聚合梅, 0.4 mmol dNTP, 2.0 mmol MgCl2. 反应条件: 94℃变性5 min, 35个循环(94℃变性5 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸1.5 min), 终止延伸72℃ 5 min. PCR产物经18 g/L琼脂糖凝胶电泳, 0.5 mg/L溴化乙锭染色, 于紫外光灯下显影. 以菌株NCTC11637CagA阳性作阳性对照, 去离子水作空白对照.

1.2.3 E-test药敏试验: 按随机数字表随机抽取50株菌株用无菌棉拭子分别刮取数个经72 h传代纯培养的H pylori菌落置于5 mL无菌生理盐水中, 在麦氏比浊仪以1.0麦氏单位为标准调整菌液浓度. 在无菌操作室分别用无菌棉拭子醮取已制备好的菌悬液, 均匀涂布于H. pylori非选择性培养基平板上, 放置2-3 min, 待平板表面凉干后用无菌眼科镊将4种E-test药敏试条AC、CH、MZ和TC呈同心等距离放射状置于平板上, 贴完E-test药敏试条后马上将平板置于37℃微需氧环境培养72 h后判读结果. 培养后围绕药敏试条可形成一个椭圆形的抑菌圈, 抑菌圈和试条的横向相交处的刻度读数即是抗菌药物对H pylori的最低抑菌浓度(MIC). 甲硝唑MIC>32 mg/L, 四环素MIC>16 mg/L, 阿莫西林MIC>8 mg/L, 克拉霉素MIC>2 mg/L定为耐药, 参照国外Gu和国内史彤 et al研究结果[7-8]. 药敏质控采用NCTC11637质控菌株与实验同步进行, 对E-test药敏试条及所配培养基等实验条件进行全面质控.

2 结果
2.1 CagA与上消化道疾病的关系

CagA在上消化道疾病的表达率为76.0%(38/50), 其中消化性溃疡(PU)患者感染的菌株CagA表达率为73.1%(19/26), 慢性胃炎(CG)患者感染的菌株CagA表达率为79.2%(19/24), 两者差异无显著性(χ2 = 0.254, P = 0.614>0.05). 说明CagA在不同上消化道疾病中的表达无差别. CagA在男性患者中的表达率为74.1%(20/27), 在女性患者的表达率是78.3%(18/23), 两者比较χ2 = 0.117, P = 0.730>0.05, 差异无显著性.

2.2 H. pylori对常用抗生素的耐药情况

阿莫西林(AC)没有耐药菌株, 耐药率0.0%; 其他三种药物的耐药率分别为: 甲硝唑(MZ)86.0%(43/50)、四环素(TC)4.0%(2/50)、克拉霉素(CH)6.0%(3/50). AC耐药率为0.0%, 不参与统计分析, 其他三种药物耐药率之间比较χ2 = 100.5515, P = 0.0001. 说明三种药物耐药率之间存在差异; 两两比较, MZ与CH比较χ2 = 64.4122, P = 0.0001; MZ与TC比较χ2 = 67.9192, P = 0.0001; CH与TC比较P = 1.0000; 说明MZ的耐药率明显高于CH和TC.

2.3 CagA与耐药的关系

38例CagA阳性菌株中有34例耐药, 耐药率为89.5%(34/38); CagA阴性菌株的耐药率为75.0%(9/12), 两者比较χ2 = 0.612, P = 0.434>0.05, 差异无显著性.

3 讨论

H. pylori是人类最常见的一种致病菌, 是PU和CG的重要致病因素之一, 与胃癌的发生有密切关系. 人群中H pylori的感染率约为50%左右, 仅有少部分人表现出不同程度的症状. 据研究, H. pylori菌株不同亚型对临床结局有相当大的影响[1]. 这与H. pylori的毒力相关. CagA是H. pylori主要的毒力因素之一, 是该菌重要的致病因子, 可以作为评价H. pylori毒力的指标. CagA基因的表达具有明显的地域差异. 西方国家分离的H. pylori菌株中约60%具有CagA基因, 并且发现CagA阳性与疾病严重程度呈正相关[2]. 陈学军 et al[3]研究我国浙江人群的H. pylori CagA阳性率高达96%, 但CagA阳性与疾病类型和疾病严重程度无关. 宫月华 et al[4]研究中国庄河胃癌高发区H. pylori CagA的阳性率为94.4%, 其与低发区没有差别. 而于金龙 et al[5]研究发现胃癌组织H. pylori CagA阳性率显著高于萎缩性胃炎组织和正常组织. 我们采用针对H pylori CagA基因保守区的特异性引物进行PCR检测, 结果显示广西地区人群感染H. pylori CagA阳性菌株为76.0%, CagA的表达在H. pylori相关的PU和CG之间没有显著差异, 其在不同性别人群中的表达亦无显著差异. 广西地区胃十二指肠疾病患者H. pylori CagA阳性菌株感染率介于西方发达国家和我国的浙江等发达地区之间, 远高于广西巴马老年人CagA阳性菌株感染率14.6%[6]. 目前临床上使用抗生素和制酸剂清除H. pylori感染, 由于H pylori根除中抗生素的广泛使用, 致使H. pylori对常用抗生素的耐药性日趋严重, 在很大程度上增加了药物治疗的困难[7-9], 而细菌耐药的产生与该药的使用频率和剂量有关. 成虹 et al[10]用E-test法对我国北京地区H. pylori的耐药性进行研究, 结果显示甲硝唑的耐药率为40.9%, 克拉霉素的耐药率为15.7%, 159例阿莫西林耐药试验中仅发现1例耐药. 史彤 et al[8]用E-test法测得上海地区克拉霉素耐药率为10.0%. 黄频 et al[11]用琼脂扩散法测得杭州地区人群甲硝唑的耐药率为98.1%, 阿莫西林耐药率是70.48%, 克拉霉素的耐药率为18.1%. 郑云鹏 et al[12]研究发现河南地区阿莫西林耐药率为9.3%, 甲硝唑耐药率为53.5%, 且出现多重耐药菌株. 在发达国家甲硝唑的耐药率为10.0%-50.0%, 克拉霉素的耐药率为2.0%-15.0%, 而这一数字有上升的趋势. 在发展中国家甲硝唑的耐药率为70.0%-90.0%[13-14]. 吕凤臣、单蕴 et al研究发现H. pylori的耐药性与用药史有关, 随着抗生素的滥用其耐药率逐年上升, 但阿莫西林耐药率低且与用药史无关[15-16]. 本实验用E-test法测得广西地区H. pylori对甲硝唑的耐药率为86.0%, 远高于我国北京地区. 克拉霉素的耐药率为6.0%, 四环素的耐药率为4.0%, 低于以上文献报道. 可能是由于本地区甲硝唑为临床常用药品, 其使用频率较高, 所以致H. pylori耐药率高; 而使用克拉霉素尚不普遍. 本实验未发现对阿莫西林耐药的菌株. CagA基因的表达与H pylori的耐药率关系国内外文献报道较少, 本实验结果显示CagA基因的表达和H. pylori的耐药性无明确关系. 尽管CagA基因已明确为评价H. pylori毒力的指标之一, 且与其他Cag族基因共同构成H. pylori的"致病岛", 但其确切的致病作用目前尚不清楚, 其与H. pylori耐药性的关系更有待进一步研究. 本研究显示CagA基因与上消化道疾病有密切关系, 在广西地区H. pylori对甲硝唑有很高的耐药性, 而对克拉霉素和四环素的耐药性较低, 未发现对阿莫西林耐药的菌株. 因此, 在本地区临床上抗H. pylori治疗时有条件的单位应进行H. pylori的药敏试验, 以指导用药. 无药敏试验时, 应该首选阿莫西林、克拉霉素和四环素, 尽量避免使用甲硝唑.

评论
背景资料

研究发现, 胰腺腺泡细胞凋亡或坏死的不同死亡方式对急性胰腺炎(AP)病情轻重起着重要作用, 腺泡细胞的凋亡可能是AP时机体的自我保护性机制而有助于减轻重症程度. 与坏死不同, 细胞凋亡的发生受凋亡调控基因控制, 细胞裂解成凋亡小体并保持膜的完整性, 不释放溶酶体酶等细胞内容物, 不引起炎症反应. 因此, 深入研究AP腺泡细胞凋亡机制, 对于明确AP病理生理过程及阻止重症化进展具有重要意义.

同行评议者

邵先玉, 主任医师, 泰山医学院附属医院消化内科.

研发前沿

H. pylori的致病性与其亚型有关, 但是其机制尚未明确, 需进一步研究. 而H. pylori根除过程中抗生素的大量运用, 使得耐药问题日趋严重, 而且在不同的地域其表现不同, 分布不同的机制亦需进一步研究.

应用要点

本文对广西地区H. pylori的CagA基因表达及其耐药情况作探讨, 希望能对本地区消化临床工作有所帮助.

同行评价

本文具有一定的创新性和可读性, 能较好地反映我国胃肠病学临床和基础研究的先进水平, 对广西地区幽门螺杆菌的研究和消化临床工作有指导意义.

编辑:李军亮 电编:何基才

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