土槿皮乙酸对BEL-7402细胞凋亡、线粒体膜电位及COX-2蛋白表达的影响

摘要

目的: 探讨土槿皮乙酸(PAB)对人肝癌细胞株BEL-7402增殖和凋亡的影响及其影响机制.

方法: 体外培养肝癌BEL-7402细胞, 用不同浓度PAB作用不同时间后, MTT比色法检测PAB对细胞增殖的影响; 流式细胞仪分析PAB对细胞周期和凋亡的影响; 吖啶橙染色荧光显微镜下观察PAB引起的肝癌细胞株BEL-7402形态学变化; JC-1检测线粒体膜电位的变化; Western blot方法检测PAB对COX-2表达的影响.

结果: PAB作用细胞24, 48, 72 h, 细胞增殖受到抑制, 且表现为剂量依赖性和时间依赖性; PAB使肝癌细胞细胞周期阻滞于G₂/M期; 与对照组相比, 2.0, 4.0 μmol/L PAB作用24 h后, 细胞凋亡率明显增加, 差异显著(19.06%±3.87%, 31.19%±1.46% vs 0.10%±0.08%, P<0.05); 吖啶橙染色发现1.0 μmol/L PAB作用24 h, 细胞内即有凋亡小体出现; 与对照组相比, 0.5 μmol/L PAB作用24 h即可降低BEL-7402线粒体膜电位(P<0.05); 不同浓度PAB作用24 h后, 随PAB浓度增加COX-2蛋白表达递减.

结论: PAB通过降低BEL-7402线粒体膜电位、减少COX-2的表达抑制细胞生长, 诱导细胞凋亡.

关键词: 土槿皮乙酸; 细胞凋亡; 线粒体膜电位; 环氧化酶; MTT比色法; 流式细胞术; 免疫印迹

Effects of pseudolaric acid B on the apoptosis, mitochondrial membrane potential and cyclooxygenase-2 expression in hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402

Xiao-Hua Ju, Yong-Hong Xu, Yan Li

Xiao-Hua Ju, Yong-Hong Xu, Yan Li, Department of Gastroenterology, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China

Supported by: the Tackle-Key-Problem Project of Education Department Project of Liaoning Province, No. 2004D186.

Correspondence to: Yan Li, Department of Gastroenterology, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, 36 Sanhao Street, Heping District, Shenyang 110004, Liaoning Province, China. yanli0227@126.com

Received: January 12, 2008
Revised: February 28, 2008
Accepted: April 11, 2008
Published online: April 18, 2008

Abstract

AIM: To investigate the effects of pseudolaric acid B (PAB) on the cell cycle arrest and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402 and the related mechanism.

METHODS: Hepatocellular carcinoma line BEL-7402 cultured in vitro was treated with various concentrations (0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L) of PAB at various intervals. Cell proliferation was examined by MTT assay. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry, and nuclear condensation in BEL-7402 cells was examined with acridine orange staining. The change of mitochondrial trans-membrane potential was measured by JC-1 staining and cyclooxygenase-2 (COX-2) protein expression was detected by Western blot.

RESULTS: Various concentrations of PAB inhibited the growth of BEL-7402 cells in a dose- and time-dependent manner. PAB induced apoptosis and cell cycle arrest at G₂/M phase. BEL-7402 cells treated with 2.0, 4.0 μmol/L PAB for 24 h showed significantly enhanced apoptosis as compared with the control cells (19.06% ± 3.87%, 31.19% ± 1.46% vs 0.10% ± 0.08%, P < 0.05). With acridine orange staining, we observed apoptotic body after the cells were treated with 1.0 μmol/L PAB for 24 h. After the cells were treated with 0.5 μmol/L PAB for 24 h, the mitochondrial membrane potential declined significantly. The expression of COX-2 protein in BEL-7402 cells decreased in a dose-dependent manner.

CONCLUSION: PAB may inhibit the proliferation and induce the apoptosis of BEL-7402 cells by depolarization of the mitochondrial membrane potential and down-regulation of the COX-2 expression.

Key Words: Pseudolaric acid B; Apoptosis; Mitochondrial membrane potential; Cyclooxygenase-2; Methyl thiazolyl tetrazolium assay; Flow cytometry; Western blot

0 引言

土槿皮是松科植物金钱松的根皮, 土槿皮乙酸(pseudolaric acid B, PAB)是土槿皮主要的生物活性成分, 与雷公藤总甙同属于二萜类化合物, 分子式为C23H28O8. 近年研究发现PAB具有抗肿瘤作用, 其可以抑制胃癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡[1-4], 但其具体机制尚不完全清楚, 并可能因为细胞类型的不同而存在差异[5-8].

目前, 随着对细胞凋亡机制研究不断深入, 线粒体在细胞凋亡中的作用受到关注. 在凋亡过程中, 线粒体有两个重要作用, 首先他以ATP的形式提供细胞凋亡所需的能量. 其次, 在细胞尚未发生形态改变时, 细胞内线粒体已开始一系列活动, 如线粒体跨膜电位(△ψm)降低、膜发生渗透性转换、线粒体释放凋亡特异性酶激活物细胞色素C及凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)等, 最终决定细胞凋亡发生与否. 因此, 线粒体被认为是细胞凋亡的调控器[9-10].

本研究观察PAB对肝癌细胞BEL-7402增殖及凋亡的影响, 探讨线粒体膜电位及COX-2在PAB诱导细胞凋亡过程中的变化, 旨在认识PAB抗肿瘤作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

PAB(中国药品生物制品检定所, 分子量432.5 g/mol, 批号110880-200502). RPMI 1640 培养基(Hyclone公司), 胎牛血清(天津灏洋生物制品公司), 胰酶(Amresco公司), 噻唑蓝MTT (南京凯基生物发展有限公司), Hoechst 33258 (Sigma公司), 碘化丙啶(propidium iodide, PI, Sigma公司), 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1(南京凯基生物发展有限公司), COX-2, actin羊抗人多克隆一抗和辣根酶标记兔抗山羊IgG(Santa Cruz Biotechnology). 人肝癌细胞株BEL-7402由中国医科大学细胞生物教研室提供.

1.2 方法

1.2.1 细胞系及细胞培养: 细胞接种在含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青链霉素的RPMI 1640培养基中, 在37℃、体积分数为50 mL/L CO₂、95%湿度培养箱中培养. 细胞单层贴壁生长, 48-72 h传代.

1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖: 人肝癌细胞株BEL-7402细胞密度调整为4-5×10⁷/L, 接种于96 孔培养板, 每孔100 μL. 培养12 h, 分别加入浓度为0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L PAB, 培养24, 48, 72 h, 每孔加入MTT 15 μL(5 g/L), 继续培养4 h 后, 弃上清, 每孔加入150 μL二甲基亚砜, 避光振荡15 min后, 酶标仪于590 nm波长下检测各孔吸光度值(A值), 绘制量效曲线. 细胞抑制率(%) = (1-加药组平均A值/对照组平均A值)×100%.

1.2.3 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率: 分别收集被0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L PAB作用24 h的肝癌细胞, 调整细胞数约为1×10⁶, PBS洗涤细胞2次, 加入700 mL/L乙醇, 置4℃固定过夜.检测时用PBS洗涤细胞两次, PI复合染液避光染色20 min后行流式细胞仪检测. Cell Quest软件获取单个细胞104个, 用Mod Fit LT软件分析细胞周期和凋亡率.

1.2.4 细胞形态学观察: 10 mg吖啶橙溶于100 mL pH为6.8的PBS中, 滤过, 4℃避光保存. 收集药物作用后的各组细胞, PBS液洗涤2遍, 制成活细胞悬液, 浓度为10¹⁰ cells/L, 取95 μL细胞悬液, 加入5 μL吖啶橙储存液混匀, 吸1滴混合液点于洁净玻片上, 直接用盖玻片封片, 荧光显微镜观察, 摄片.

1.2.5 检测△ψm: PAB作用24 h的肝癌细胞, 用PBS洗涤细胞2次, 收集不多于1×10⁶的细胞; 取500 μL 10×incubation Buffer加4.5 mL灭菌去离子水稀释成1×incubation Buffer, 混匀并预热至37℃; 吸取2.5 mL 1×incubation Buffer, 加入5 μL JC-1, 涡旋混匀配成JC-1工作液; 取500 μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮, 37℃, 50 mL/L CO2的培养箱中孵育15-20 min; 室温离心(2000 r/min, 5 min)收集细胞, 用1×incubation Buffer洗两次; 吸取500 μL 1×incubation Buffer重新悬浮细胞; 流式细胞仪(Ex = 488 nm; Em = 530 nm)检测细胞凋亡的情况. 荧光显微镜观察: 滴1滴上述细胞悬液于载玻片, 盖上盖玻片, 于荧光显微镜下观察, 照相.

1.2.6 检测COX-2表达: 收集BEL-7402细胞, 用冰冷的PBS洗涤细胞2次, 4℃, 3000 r/min离心5 min, 去上清, 立即置于冰上; 加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂混合液, 吹打均匀, 冰上放置20 min; 4℃离心, 14 000 r/min, 10 min; 将上清液转移至另一干净的离心管中, 取部分上清液测定蛋白质浓度. 取等蛋白量样品上清液与2×样品缓冲液混匀后于沸水浴中煮沸3 min, 上样, 用SDS-PAGE进行电泳, 转膜, 加入actin山羊多克隆抗体和COX-2山羊多克隆抗体, 室温孵育2 h, 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗和兔抗山羊IgG二抗室温孵育1 h; 混合等体积的A液和B液, 与PVDF膜共孵育5 min, 于暗室中进行曝光、显影、定影; 以凝胶成像系统进行成像及数据采集.

统计学处理 所有实验数据均采用mean±SD表示, 用SPSS13.0软件进行t检验.

2 结果

2.1 BEL-7402生长的抑制作用

0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L PAB对细胞作用24, 48, 72 h, 抑制细胞生长, 且表现出明显的剂量依赖性和时间依赖性. 2.0 μmol/L PAB对BEL-7402作用72 h, 抑制率接近100%(图1).

图1 不同浓度PAB作用不同时间对BEL-7402生长的抑制

2.2 细胞周期和凋亡率

PAB对BEL-7402细胞作用24 h, 随着浓度的增加, G₀/G₁、S期细胞逐渐减少, G₂/M期细胞逐渐增多, 提示细胞周期阻滞于G₂/M期; 与对照组相比, 2.0, 4.0 μmol/L PAB作用24 h后, 细胞凋亡率明显增加(表1).

表1 不同浓度PAB作用24 h对BEL-7402细胞周期和凋亡率的影响 (mean±SD, %).

PAB浓度(μmol/L)	G0/G1	S	G2/M	凋亡率
0	73.62±1.38	26.28±0.83	0.10±1.48	0.10±0.08
0.5	70.97±2.97	22.82±2.63	6.21±0.36	0.23±0.16
1	60.06±1.40a	20.11±2.31	13.83±4.67a	5.39±2.67
2	28.66±2.31a	15.47±3.17a	55.87±3.87a	19.06±3.87a
4	0.61±0.12a	1.96±0.07a	97.43±1.46a	31.19±1.46a

^aP<0.05 vs 对照组.

2.3 吖啶橙染色

吖啶橙荧光染色可较清楚地显示凋亡细胞的胞体与胞核形态. 正常细胞核结构正常、均呈绿色荧光(图2A). 1.0 μmol/L PAB作用24 h后, 荧光显微镜下观察到典型的细胞凋亡特征性变化: 凋亡细胞胞核呈固缩状的或半月形绿色荧光或橘黄色荧光(图2B).

图2 BEL-7402凋亡细胞胞体与胞核形态. A: 正常BEL-7402细胞; B: 1.0 μmol/L PAB作用24 h

2.4 △ψm

JC-1在正常细胞内聚集在线粒体内, 形成多聚体, 呈鲜红色荧光, 但在凋亡细胞内, 由于△ψm的破坏, 不能聚集到线粒体内, 以单体的形式存在于胞质发绿色荧光. 荧光强度的变化反映△ψm的变化. 流式细胞仪用红色荧光降低的百分比表示△ψm的降低. 该试验发现PAB处理细胞后线粒体由黄绿色变为绿色. BEL-7402细胞经0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L PAB作用24 h后, 线粒体膜电位降低, 分别是33.46%±0.87%、51.97%±1.42%、63.34%±2.67%、70.78%±7.39%和77.62%±8.13%, 提示线粒体膜电位发生去极化(图3).

图3 BEL-7402的JC-1染色. A: 正常BEL-7402细胞; B: 0.5 μmol/L PAB对BEL-7402作用24 h

2.5 COX-2蛋白表达

BEL-7402细胞随药物浓度的增加, COX-2蛋白表达减少, 2.0, 4.0 μmol/L PAB处理组尤为明显(图4).

图4 不同浓度PAB作用BEL-7402细胞24 h后COX-2蛋白表达情况. A: β-actin蛋白表达情况; B: COX-2蛋白表达情况; 1-5: 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 μmol/L PAB

3 讨论

PAB是从金钱松的根皮提取出来的二萜类化合物. 在民间PAB主要用于治疗皮肤真菌感染、终止早期妊娠, 近年来研究发现PAB具有抗肿瘤及抑制肿瘤血管发生的作用, 从而引起人们的广泛关注. PAB主要抑制增殖活跃的肿瘤细胞的生长, 对源于正常组织生长缓慢的细胞影响甚微, 在移植瘤动物模型中, 有效剂量内并未观察到毒性反应, 而且PAB可以抑制P-糖蛋白过表达引起的肿瘤耐药[1]. PAB作为一种新的微管蛋白结合剂, 通过不同于长春新碱和秋水仙素微管蛋白结合位点的直接作用, 可使微管蛋白解聚, 显著抑制人微血管内皮细胞的增殖、迁移和腔管形成, 而且可清除动物体内新形成的内皮腔管和微血管[8].

我们采用不同浓度的PAB对人肝癌细胞株BEL-7402作用不同时间, 发现细胞增殖受到明显抑制, 细胞周期阻滞于G₂/M期; 同时吖啶橙染色观察到典型的凋亡细胞, JC-1染色流式细胞仪检测表明PAB作用后线粒体膜电位降低. Ko et al[3]的研究亦发现PAB通过使人结肠癌细胞株HT-29细胞周期阻滞于G₂/M期, 调节细胞周期蛋白的表达, 下调c-myc, 从而抑制肿瘤细胞的生长, 诱导细胞凋亡. 这与本实验的结果一致.

我们发现PAB可使肝癌细胞BEL-7402阻滞于G₂/M期, 从而抑制细胞的有丝分裂. 这可能是由于PAB裂解细胞微管网状系统, 抑制有丝分裂纺锤体的形成[1]. △ψm是线粒体发挥正常生理功能所必需的, 线粒体膜完整的脂质双层结构保障了△ψm的存在, 一旦膜完整性遭到破坏, 将致使△ψm下降, 从而使线粒体氧化还原状态失常, 引发呼吸链的解耦联等. 这些因素足以使细胞因无法得到正常能量供给而发生凋亡或坏死. 本实验应用JC-1染色, 通过流式细胞仪检测△ψm的变化, 发现△ψm随PAB药物浓度的增加而下降. PAB降低△ψm诱导凋亡的机制尚不明确, 可能是PAB降低线粒体膜电位后直接激活线粒体途径的凋亡通路[11-13]. 由于△ψm下降, 从线粒体外室释放的AIF激活caspase-3, 同时从线粒体释放出来的细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1)和caspase-9形成复合体, 活化caspase-3, 从而引起细胞凋亡[14-15].

近年来研究表明, COX-2除在炎症反应中起重要作用外, 尚与肝癌、结肠癌等肿瘤的发生密切相关[16-17]. COX-2通过其催化产物PGE2刺激肿瘤细胞的增殖[18]; 阻断细胞色素C释放, 抑制肿瘤细胞凋亡[19]; 上调bcl-2的表达, 增强AKt激酶介导通路抑制细胞凋亡[20]; 诱导肿瘤细胞产生PGE2、VEGF等, 促进肿瘤血管发生[21-22]; 活化基质金属酶(matrix metalloproteinases, MMP)-9[23],增加肿瘤细胞的侵袭力[24]; COX-2诱导P-糖蛋白表达, 导致肿瘤细胞耐药[19]. 选择性COX-2抑制剂可诱导高表达COX-2的肿瘤细胞凋亡, 抑制肿瘤血管发生、侵袭和转移, 并可与化疗药起协同作用, 说明COX-2是治疗肿瘤的一重要靶点[17,25-26]. BEL-7402强表达COX-2[27-28]. 我们发现2.0 μmol/L PAB作用24 h后, COX-2蛋白表达即明显减少, 同时吖啶橙染色和线粒体膜电位检测发现明显的凋亡征象, 说明PAB通过减少COX-2的表达, 诱导肿瘤细胞凋亡.

可见, PAB通过使细胞周期阻滞于G₂/M期抑制BEL-7402细胞生长; 通过降低线粒体膜电位、减少COX-2蛋白表达诱导BEL-7402细胞凋亡. 但目前有关PAB抗肿瘤作用的研究较少, 且多为体外实验, 体内实验也仅限于动物; 有关其诱导凋亡, 抑制肿瘤血管发生的机制尚未完全明确, 不同学者的研究结论也不一致. Gong et al[29]的研究发现PAB通过活化HeLa细胞的c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和caspase-3诱导细胞凋亡, JNK部分参与调整PAB引起的P53表达. Liu et al的研究发现PAB可以抑制小鼠体内移植瘤的生长; 通过上调p53, 下调Bcl-2, 活化caspase-3诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡, 但Wong et al[1]认为PAB的细胞毒性与p53状态无关. 因此, 我们仍需深入研究PAB的抗肿瘤作用机制, 从而为肿瘤的治疗以及为中药的开发和临床应用提供更多的依据.

评论

背景资料

土槿皮是松科植物金钱松的根皮, 土槿皮乙酸(PAB)是土槿皮中主要的生物活性成分, 与雷公藤总甙同属于二萜类化合物. 近年来研究发现PAB可抑制胃癌、肺癌、结肠癌、宫颈癌及黑色素瘤等多种肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡, 抗肿瘤血管生成和抑制P-糖蛋白过表达引起的肿瘤耐药, 因此, 受到人们的广泛关注.

同行评议者

吴志勇, 教授, 上海交通大学医学院附属仁济医院普外科

研发前沿

PAB可抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡, 但其具体机制尚不完全清楚, 并可能因为细胞类型的不同而存在差异.

相关报道

Tong et al研究发现PAB作为一种新的微管蛋白结合剂, 通过不同于长春新碱和秋水仙素微管蛋白结合位点的直接作用, 可使微管蛋白解聚, 显著抑制人微血管内皮细胞的增殖、迁移和腔管形成, 而且可清除动物体内新形成的内皮腔管和微血管. 这说明PAB可以抑制肿瘤血管生成.

创新盘点

本研究收集不同浓度土槿皮乙酸处理24 h的BEL-7402细胞, 应用JC-1染色、流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化, 发现随药物浓度的增加, 线粒体膜电位降低.

应用要点

现代药理实验研究表明, 土槿皮乙酸具有抗肿瘤、抗生育、抗血管生成和抗真菌等作用, 具有广阔的应用前景.

同行评价

本研究有新意, 方法适用, 论据充分, 结论可靠, 所引参考文献新, 内容广泛, 对PAB抑制肿瘤的研究有较高的价值.

备注

编辑:李军亮 电编:郭海丽

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