核苷的亲脂性磷酸酰胺酯β-LPA体外抗乙型肝炎病毒的作用

摘要

目的: 探讨β-LPA体外抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的作用.

方法: 通过β-LPA干预培养HepG2.2.2.15细胞, ELISA法检测上清HBsAg和HBeAg, ³²P标记HBV DNA为探针, Southern blot法检测细胞内的HBV DNA, 再以计算机图像处理进行定量分析, 得出50%抑制的药物浓度(ED₅₀), 以MTT法检测不同浓度药物的细胞毒性, 求出50%细胞抑制的药物浓度(ID₅₀).

结果: β-LPA体外明显抑制HBV DNA的复制, 并呈浓度依赖性. ED50为0.01 μmol/L, β-LPA细胞毒性实验显示ID₅₀为50 μmol/L. 低浓度的β-LPA对上清HBsAg, HBeAg无明显影响, 高浓度时有显著的抑制作用.

结论: β-LPA具有明显的体外抑制病毒DNA复制作用, 且细胞毒性小.

关键词: 乙型肝炎病毒; 核苷的亲脂性磷酸酰胺酯; 核苷类; 酶联免疫法

In vitro effects of a novel nucleoside analog beta-LPA against hepatitis B virus

Ting Chen, Xing-Xing He, Shao-Hua Peng, Ju-Sheng Lin, Ying Chang, Li-Feng Liu

Ting Chen, Xing-Xing He, Ju-Sheng Lin, Ying Chang, Li-Feng Liu, Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Ting Chen, Shao-Hua Peng, Medical Department of Xianning Medical Collage, Xianning University, Xianning 437100, Hubei Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 30330680.

Correspondence to: Ju-Sheng Lin, Institute of Liver Diseases, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China. jslin@tjh.tjmu.edu.cn

Received: October 17, 2007
Revised: March 5, 2008
Accepted: March 28, 2008
Published online: April 8, 2008

Abstract

AIM: To explore the in vitro effects of a novel nucleoside analog (β-LPA) against hepatitis B virus (HBV).

METHODS: HepG2.2.2.15 cells were cultured and treated with various concentrations of β-LPA. Serum HBsAg and HBeAg were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Intracelluar DNA was extracted and subjected to Southern blotting, hybridized with ³²P-labeled HBV probe and autoradiographed. The intensity of the autoradiographic bands was quantified by densitometric scans of computer and ED₅₀ value was calculated. Cytotoxicity with different concentrations of drugs was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method and ID₅₀ value was calculated.

RESULTS: Autoradiographic bands showed that β-LPA inhibited the replication of HBV DNA in a dose-dependent manner. ED₅₀ value was 0.01 μmol/L. Cytotoxicity experiment showed that the ID₅₀ value of β-LPA was 50 μmol/L. The contents of HBsAg and HBeAg were decreased in a concentration-dependent manner. β-LPA at a low concentration had no marked effect on HBsAg and HBeAg in supernate.

CONCLUSION: β-LPA possesses potent inhibitory effect on the replication of HBV in vitro with little cytotoxicity.

Key Words: Hepatitis B virus; β-LPA; Nucleoside; Enzyme-linked immunosorbent assay

0 引言

乙型肝炎是一种全球性广泛传播的传染性疾病, 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B virus, CHB)的最主要因素[1]. 尽管乙肝疫苗已应用多年[2-4], 据世界卫生组织调查结果, 全球大约有20亿人感染过或者正在感染HBV, 其中CHB患者约有3.5亿人. 每年死于乙肝相关性疾病约100万例[5]. CHB最终可能发展为肝硬化、肝癌[6-7], 所以慢性乙型肝炎是严重危害人类健康的一种疾病. 目前用干扰素或核苷类似物如拉米夫啶、阿德福韦等治疗慢性乙型肝炎, 疗效不理想, 特异性差, 易出现耐药性[8-10]. 因此, 研制和开发新的高效低毒的抗HBV药物已成为当务之急. 我们在体外HepG2.2.2.15细胞培养的基础上, 通过新型核苷类化合物核苷的亲脂性磷酸酰胺酯β-LPA干预, 探索β-LPA体外抗HBV的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2.2.2.15细胞引自美国Yale大学医学院, HepG2本室保存; P3.6Ⅱ质粒菌株由本室保存; DMEM干粉及胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司; β-LPA由武汉大学药学院辅助合成的化合物(核苷的亲脂性磷酸酰胺酯), 以磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)溶解为21 mmol/L的贮存液; 拉米夫啶, ddc由美国Yale大学药学院Cheng教授提供, 以磷酸盐缓冲液(PBS, pH7.4)溶解为10 mmol/L的贮存液; ³²P-dCTP购于中国同位素公司, 尼龙膜 (Hgbond-N⁺)购自Amersham Pharmacia Biotech; HBsAg, HBeAg的ELISA检测试剂盒购自上海科华公司; MTT购自瑞士Fluka公司; XbaⅠ和PstⅠ限制性内切酶均购自Fermenter公司, dNTP购自 Promega, G418(新霉素)、青霉素、链霉素、氨苄青霉素购自凌飞科技公司.

1.2 方法

用含400 mg/L G418细胞培养基培养1 mo, 筛选出合乎要求的HepG2.2.2.15.将筛选出来HepG2.2.2.15细胞接种于12孔板, 细胞数为5×10⁴/孔, 加培养液1 mL/孔, 培养液含100 mL/L胎牛血清、青霉素10万 U/L、链霉素100 mg/L. 接种后3 d换用含药培养液, 每个药物浓度点设2个平行孔, 同样条件下培养9 d, 每3 d换含药培养液1次, 以拉米夫啶为阳性对照组, 浓度为1 μmol/L; 设立阴性对照孔组, 即不加药物培养. HepG2细胞作为空白对照. 于12 d回收全部细胞. 机制试验设立β-LPA 1、0.1、0.01、0.001 μmol/L 等含药浓度点. 每孔加入上清液50 μL, 原液不做稀释, 按ELISA试剂盒说明进行HBsAg及HBeAg检测. 酶标仪450 nm波长读数(参考波长630 nm), 结果以P/N值表示, P/N值 = 标本A/阴性对照A值. 抑制率 = (未加药对照孔P/N值-实验孔P/N值)/(未加药对照孔P/N值-2.1)×100%.

1.2.1 细胞毒性: HepG2.2.15细胞接种于96孔板, 1×10⁴/孔, 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液200 μL, 置37℃、50 mL/L CO₂温箱培养使细胞贴壁. 24 h后加入含不同浓度的药物培养基处理, 如拉米夫啶1 μmol/L、β-LPA 25、50、75、100、125 μmol/L, 同时设置调零孔(调零孔只加培养基、MTT、二甲基亚砜, 不加细胞)和对照孔(对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜, 不同的是对照加溶解药物的介质, 而加药组加入不同浓度的药物), 每个浓度组设定3复孔, 3 d后回收全部细胞, 用MTT比色法检测细胞吸光度值, 与对照孔的吸光度值(存活细胞100%)比较, 计算存活细胞百分比, 并计算出半数抑制浓度(ID₅₀).

1.2.2 Southern印迹检测细胞内HBV DNA: 去上清液后, 收集12孔板每孔内的细胞, 按DNA抽提试剂盒操作说明, 提取细胞内总的DNA. 细胞内的DNA于8 g/L琼脂糖凝胶电泳, 尼龙膜印迹, ³²P标记HBV DNA探针杂交, 2×SSC/0.5% SDS室温1 h, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 65℃ 4 h洗膜、放射自显影. 显影条带经计算机图像处理进行定量分析, 求出50%抑制的药物浓度(ED₅₀). 所有的试验重复三次.

统计学处理 所有数据采用mean±SD表示, 用单因数的方差分析, 数据分析在SPSS12.0完成. P<0.05有统计学意义.

2 结果

2.1 HbsAg和HBeAg检测结果

β-LPA于低浓度时对HBsAg和HBeAg无明显抑制作用, 1 μmol/L时对两者有抑制作用(表1).

表1 β-LPA抑制HBsAg, HBeAg的量效关系 (mean±SD, n = 3).

分组	浓度(μmol/L)	HBsAg		HBeAg
		P/N值	抑制率(%)	P/N值	抑制率(%)
空白对照		4.07±0.13	0	7.33±2.25	0
拉米夫啶	1	3.86±0.12a	28.5	3.19±1.31b	29.2
β-LPA	1	3.77±0.08a	42.3	2.39±0.14b	35.8
	0.1	3.81±0.20	22.4	4.37±2.25	15.1
	0.01	3.83±0.16	14.1	5.17±3.44	12.6
	0.001	3.91±0.08	8.1	5.68±3.95	8.1

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 空白对照组.

2.2 β-LPA的细胞毒性

治疗剂量范围内细胞毒性小, 超大剂量检测可见细胞毒性, 并呈明显的浓度依赖性. 根据检测的A值, 计算出细胞生长抑制率(图1), 计算出ID₅₀为50 μmo1/L.

图1 β-LPA抑制细胞生长曲线.

2.3 β-LPA抑制HBV DNA复制

细胞内HBV DNA印迹结果显示, 0.1 μmol/L β-LPA同1 μmol/L拉米夫啶的作用相当, 1 μmol/L β-LPA时, 几乎完全抑制HBV DNA的复制; β-LPA对细胞内HBV DNA的抑制呈现明显的量效关系(图2), 计算机图像处理分析, 以不加药空白对照组细胞内的HBV DNA灰度计为1, 测量出各组的灰度值, 再求出HBV DNA抑制百分率, 并绘出浓度与抑制率关系曲线, 最后分析出ED50为0.01 μmol/L.

图2 β-LPA细胞内抗HBV DNA复制作用. 1-2: 阴性对照; 3-4: 拉米夫啶1 μmol/L; 5-6: β-LPA 1 μmol/L; 7-8: β-LPA 0.1 μmol/L; 9-10: β-LPA 0.01 μmol/L; 11-12: β-LPA 0.001 μmol/L; 13-14: 空白HepG2.

3 讨论

HBV的感染在全球范围内是一个重要的社会公共卫生问题. 虽然, 正在应用的HBV疫苗对HBV感染的预防起到了一定的作用, 但是HBV感染仍然是医学界的一个棘手问题. 拉米夫啶在抗HBV治疗方面显示了良好的结果, 不仅能快速降低血清HBV滴度, 而且能长期的抑制病毒的复制, 有效改善患者的肝脏病变, 但是停药后的反弹和耐药株的出现, 仍然是有待解决的问题[11-12], 为新的核苷类化合物开发提出了迫切的需要[13].

β-LPA的量效关系研究显示, β-LPA处理后, 细胞内的HBV DNA得到明显的抑制, 并呈现明显的剂量依赖性, 利用图像处理软件ImageTool(IT)3.0进行灰度分析得ED₅₀为0.01 μmol/L. 同拉米夫啶相比较, β-LPA具有相似的高效抑制HBV DNA复制作用. 细胞毒性实验显示, 治疗剂量无明显细胞抑制作用, 超大剂量实验获得50%细胞抑制浓度, 即ID₅₀为50 μmol/L. 治疗指数(therapeuticindex, TI) = ID₅₀/ED₅₀, β-LPA的TI为5000. 以往实验报道拉米夫啶的TI为750. 可见, β-LPA具有强效抑制HBV病毒复制作用, 并具有更高的治疗指数. β-LPA不仅在病毒的复制水平上对HBV DNA有抑制作用, 同时在翻译水平上也有一定的抑制作用. 目前治疗乙型肝炎没有完全有效的方法, 干扰素和核苷类似物都有不同程度的缺陷[14-15]. 我们在国内合成的新的核苷类化合物β-LPA, 显示良好的势头, 作为新一类核苷类化合物, 同拉米夫啶相比较, β-LPA具有相类似的高效抑制HBV DNA复制作用, 细胞毒性小, 可望成为有效的抗HBV类药物, 也有望联合用药提高疗效或缩短用药疗程, 并减少变异株与耐药株的出现.

评论

背景资料

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的全球性问题. 尽管乙肝疫苗、干扰素及核苷类化合物已应用于抗HBV, 但效果均不理想. 全世界60亿人口中, 仍约有3.5亿人感染HBV, 其中25%-40% HBV慢性感染者最终将发展为肝硬化和肝细胞癌. 每年死于乙型肝炎相关性疾病约100万例.

同行评议者

党双锁, 副教授, 西安交通大学第二医院感染科

研发前沿

近年来, 国际上抗HBV药物研究的趋势之一是对核苷类化合物的研制, 如拉米夫啶、阿德福韦、恩替卡韦、克拉夫啶等, 但在应用中均有产生耐药株与变异株的局限, 基于目前现状, 研制高效低毒、无药物反弹的新核苷类药物已迫在眉睫.

创新盘点

本文以β-LPA干预培养HepG2.2.2. 15细胞, ELISA法检测上清HBsAg, HBeAg; ³²P标记HBV DNA为探针, Southern印迹法检测细胞内的HBV DNA, 探索β-LPA体外抗HBV的作用. 这对于研制和开发新型抗HBV药物可能是一个新的研究方向.

应用要点

β-LPA具有高效低毒的抗HBV作用, 有望成为新的抗HBV药物.

同行评价

本文实验设计合理, 方法得当, 结果可靠, 有重要的参考价值, 是一篇有较高质量的论文.

备注

编辑:潘伯荣 电编:何基才

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