十二指肠溃疡患者H. pylori根治前后NO、TNFα含量和NOS表达的变化及意义

摘要

目的: 观察H. pylori 感染对十二指肠溃疡(DU)患者NOS、NO和TNFα的影响, 探讨H. pylori感染、NO和TNFα在DU中的作用和意义.

方法: 随机选择经电子胃镜和病理检查确诊的H. pylori阳性DU患者60例, 采用快速尿素酶试验、组织涂片Gram染色和Warthin-Starry银染色进行H. pylori检测. 用兰索拉唑+阿莫西林+克拉霉素治疗7 d, 于H. pylori根治前后检测血清NO、TNFα的含量、免疫组化法检测胃窦黏膜eNOS和iNOS蛋白的表达, 并与内镜和病理检查证实胃黏膜大致正常H. pylori阴性的15名健康志愿者作对照观察.

结果: H. pylori根治率为82.14%(46/56), 溃疡愈合率89.28%(50/56). 正常人胃黏膜以eNOS表达为主、iNOS表达很少, NO、TNFα含量少, H. pylori感染后胃黏膜eNOS、iNOS表达和NO、TNFα含量较正常对照增加(3 568.78±624.34, 238.43±72.92与2 448.27±723.31, 138.53±59.65; P<0.001), iNOS表达更显著. H. pylori根除后, eNOS、iNOS的表达以及NO和TNFα含量(2 908.74±717.58, 142.43±58.63)均低于治疗前(P<0.001), 但iNOS和NO仍高于正常对照组(P<0.05).

结论: iNOS过度表达和NO、TNFα含量增加可能在消化性溃疡的发病机制中发挥一定作用, 有可能是H. pylori感染导致消化性溃疡的发病机制之一. NO在溃疡的愈合中也起一定作用.

关键词: 无

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: December 10, 2004
Revised: January 9, 2005
Accepted: January 26, 2005
Published online: March 1, 2005

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

幽门螺杆菌(H. pylori)是消化性溃疡(PU)的主要致病因子, 根除H. pylori可促进溃疡愈合, 降低溃疡复发. 至今为止H. pylori的致PU机制并未完全阐明, 由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)催化L-精氨酸生成的一氧化氮(NO)是机体的一种重要的调节递质, 其参与胃黏膜的损伤、修复和炎症反应[1]. 我们观察十二指肠溃疡(DU)患者在根治H. pylori前后体内NO、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和肿瘤坏死因子α(TNFα)含量的变化, 以探讨H. pylori感染对NO、TNFα的影响以及上述因素在DU发病及愈合中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

随机选择经电子胃镜(Olympus GIF-XQ10; Olympus Optical Co; Tokyo, Japan)和病理检查确诊的H. pylori阳性DU患者60例(男50例, 女10例, 年龄22岁-70岁, 平均43.5岁)和经胃镜和病理检查证实胃黏膜大致正常H. pylori阴性的健康志愿者15名(男12名, 女3名, 年龄20-65岁, 平均42.6岁)为研究对象. 除外严重心、肝、肾功能损害, 以及孕妇、酗酒和药物过敏者.

1.2 方法

对所有H. pylori阳性的DU患者给与兰索拉唑30 mg早餐前30 min口服+阿莫西林0.5 bid +克拉霉素0.25 bid, 连用7 d. 治疗结束后4 wk复查胃镜.

1.3 H. pylori检测

胃镜直视下于距幽门口3 cm以内的胃窦小弯、前壁、大弯处各取活检组织1块, 分别用于快速尿素酶试验、组织涂片Gram染色和Warthin-Starry银染色进行H. pylori检测. 上述方法2项或以上阳性者, 定为H. pylori阳性; 停药后4 wk上述3项试验均阴性者, 定为H. pylori根除.

1.4 NO测定

治疗前及治疗后4 wk取空腹静脉血2 mL, 室温静置析出血清后, 离心10 min, 分离血清, -70℃保存待测, 采用高效液相法同批检测, 以血清中NO₂-/ NO₃-总量间接显示体内NO的生成量.

1.5 NOS测定

治疗前及停药后4 wk钳取胃窦黏膜组织各1块, 16g/L甲醛溶液固定、脱水、包埋, 采用SABC法染色. eNOS和iNOS抗体(一抗为兔抗大鼠IgG)购自美国Santa Cruz公司, 即用型SABC试剂盒, 购自武汉博士德生物工程公司. 结果判定: 细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性, 综合染色强度及阳性细胞数, 从两方面进行半定量分析, 分别评为0-3分. 染色强度判定: 阴性(0分); 染色弱但明显强于阴性对照(1分); 染色清晰(2分); 染色强(3分). 阳性细胞数判定: ≤10%(0分); 11%-25%(1分); 26%-50%(2分); ≥50%(3分). 根据两项指标的积分数分为四级: 0-1分为"-"; 2分为"+"; 3-4分为"++"; 5-6分为"+++".

1.6 TNFα测定

治疗前及治疗后4 wk取空腹静脉血2 mL, 用EDTA抗凝, 高速离心取上清液, 置-20℃冰箱保存待测. TNFα测定用酶联免疫黏附法(ELISA), 以ng/L为单位表示血清含量.

统计学处理 计量资料用F检验和配对t检验, 计数资料用χ²检验, P<0.05为有显著差异性.

2 结果

有75例患者进入观察研究, 其中H. pylori感染组4例患者因拒绝内镜复查退出试验, 完成本研究者共71例(H. pylori感染组56例, 对照组15例), 各组年龄、性别等一般情况具有可比性(P>0.05). H. pylori根治率为82.1%(46/56), 溃疡愈合率89.3%(50/56).

2.1 DU患者H. pylori根治前后血清NO和TNFα含量的变化

DU患者在H. pylori感染时NO和TNFα含量均明显高于正常人(F = 14.4和16.1), 根除H. pylori后二者含量明显降低. 如果H. pylori根治失败, NO和TNFα的含量较治疗前有继续增高的趋势, 但无统计学意义. NO含量在H. pylori根治后低于治疗前, 但仍高于正常人, TNFα含量在H. pylori根治后含量降低接近正常人(表1).

表1 H. pylori根治前后NO和TNFa含量及与正常对照组的比较(mean±SD).

	n	NO(mg/L)	TNFa(ng/L)
H. pylori根治前	46	3 568.8±624.3d	238.4±72.9d
H. pylori根治后	46	2 908.7±717.6bc	142.4±58.6b
H. pylori根治失败	10	3 998.1±628.3d	273.4±79.4d
正常对照组	15	2 448.3±723.3	138.5±59.7

^bP<0.01 vs治疗前;

^cP<0.05,

^dP<0.001 vs正常对照组.

2.2 H. pylori根治前后胃黏膜eNOS和iNOS的表达

正常人胃黏膜可见eNOS呈弱阳性, iNOS表达很少. H. pylori感染的患者胃黏膜eNOS和iNOS表达量均明显高于正常人(P<0.001), 但后者表达更显著. 根治H. pylori后, eNOS和iNOS表达显著低于治疗前, iNOS仍较正常对照组表达增多(表2).

表2 H. pylori根治前后胃黏膜eNOS和iNOS的表达 (例).

	n	eNOS				iNOS
		-	+	++	+++	-	+	++	+++
H. pylori根治前	46	0	13	27	6d	0	4	29	13d
H. pylori根治后	46	6	34	6	0b	10	20	14	2bc
正常对照组	15	3	10	2	0	10	4	0	0

^bP<0.001 vs治疗前;

^cP<0.05,

^dP<0.001 vs正常对照组.

3 讨论

NO在消化系统有两种产生机制[1-2]: 生理状态下, 结构型一氧化氮合酶(cNOS)在胃内主要存在于内皮细胞[3], 称eNOS; iNOS不表达或很少表达, NO主要来源于cNOS, 产生量少, 具有调节胃肠黏膜局部血循环, 抑制胃酸分泌, 清除氧自由基团, 抑制血小板聚集, 改善胃肠蠕动, 保护胃肠黏膜的作用; 而在感染炎症等病理刺激时, NO主要由中性粒细胞、巨噬细胞等中的iNOS在细胞因子白介素(IL-1、IL-2)、TNF及细菌脂多糖等激活下产生, 该机制在提高机体抵抗外来微生物能力的同时, 又可对机体正常组织造成损伤. 本研究结果显示, 正常对照组胃黏膜主要表达eNOS, iNOS表达很少, 产生少量NO, H. pylori感染患者的胃黏膜组织内eNOS和iNOS表达均增多(P<0.001), 但iNOS表达更显著. NO含量明显高于正常对照组(P<0.001), H. pylori根治后NOS表达和NO含量均较治疗前下降, eNOS表达接近正常对照组, 而iNOS的表达仍高于正常对照(P<0.05); 如果H. pylori根除失败则NOS表达和NO含量均持续升高. 表明H. pylori感染不但诱导胃黏膜iNOS表达增多, 也使eNOS表达增多, 二者均参与了H. pylori相关DU的发病机制[1], 可能iNOS作用更强[4]. 血清NO含量变化曲线与NOS表达曲线相同, 说明H. pylori感染不但促进NOS的表达, 而且增强NOS的活性, NO的产生主要来源于iNOS. 随着H. pylori的根除和溃疡的愈合, eNOS的表达恢复正常, 但iNOS的表达和NO含量仍高于正常(P<0.05), 提示NO可能不仅参与了H. pylori相关PU的发病机制, 还参与了溃疡的愈合过程. 有研究报道[5-7], H. pylori感染可能通过激活NF-κB因子, 进而促进COX-2、iNOS mRNA的表达, NO的产生的量与H. pylori的感染程度呈正相关, H. pylori可通过NO途径引起鼠十二指肠黏膜上皮细胞损伤, 认为过量生成的NO可直接引起细胞毒作用或通过与氧自由基氧化生成毒性更大的过氧硝基阴离子和羟自由基, 导致组织细胞氧化损伤和坏死, 形成溃疡. 另有研究表明NO不仅参加炎症的损伤过程, 而且在炎症和溃疡愈合中也起到重要促进作用[8]. Tatemichi et al[9]研究发现溃疡愈合中, iNOS不影响溃疡愈合处的细胞再生和血管形成, 但在iNOS基因缺陷鼠, 可引起巨大胃溃疡且炎性反应严重. NO可通过调节细胞的增生与分化、胶原的沉积与血管再生, 促进损伤愈合[10]. 本研究DU患者在根除H. pylori后, iNOS和NO仍增高的原因, 可能与胃黏膜的慢性炎症的存在、治疗时间短、溃疡愈合质量不佳以及NO继续参与溃疡的修复过程有关, 这也许是其有益的一方面.

TNFα是由巨噬细胞和活化的Ｔ细胞产生, 对机体具有免疫防护和病理损伤双重的生物学作用. 本研究DU患者在H. pylori感染状态下, 血清TNFα含量增高, H. pylori根治后, 其含量下降接近正常对照组, H. pylori根治失败者TNFα含量继续升高, 并且TNFα的动态曲线与NO、NOS大致相同, 提示H. pylori感染可导致TNFα产生增多, TNFα又可刺激iNOS活性增强产生过量的NO, 从而参与PU的病生理过程. 此结果与国内外报道一致[11-12]. 过量产生的TNFα除了通过NO途径参与溃疡形成外, 本身可促使胃窦Ｇ细胞合成或释放胃泌素增加, 胃酸分泌增高[13], 并通过活化NF-κB介导胃溃疡形成[14], 用TNFα抗体可明显抑制胃泌素的释放和溃疡的形成[14-16]. 说明H. pylori感染引起的TNFα过量释放, 也是H. pylori感染导致溃疡形成的一个重要环节.

备注

编辑: 张海宁

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