大鼠重症急性胰腺炎发病机制中p38丝裂原活化蛋白激酶的作用

摘要

目的: 研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号转导通路在大鼠重症急性胰腺炎(SAP)胰腺组织中的变化规律, 探讨p38 MAPK特异性抑制剂CNI1493对SAP的保护作用.

方法: 50 g/L牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射建立雄性SD大鼠SAP模型, 随机分为SO组(假手术组, n = 30)、SAP-NS组(n = 25)及SAP-CNI1493组(n = 25), 各组大鼠质量相似. Western blot法检测大鼠胰腺组织磷酸化p38 MAPK的表达; ELISA方法检测血清IL-1β, TNF-α水平; 光镜下评估胰腺组织病理学积分.

结果: SO组胰腺组织存在磷酸化p38 MAPK弱表达, SAP-NS组造模后15 min时磷酸化p38 MAPK的表达即显著增高至峰值, 3 h后开始下降, 6 h时磷酸化p38 MAPK活性与SO组相似. SAP-NS组和SAP-CNI1493组Western blot检测15, 30 min条带光密度值5 200±360, 3 500±250和4 910±320, 2 500±340, SAP-CNI1493组15, 30 min时胰腺组织磷酸化p38 MAPK的表达显著低于SAP-NS组(P<0.01). SAP-CNI1493组3, 6 h时间点血清IL-1β, TNF-α水平及3 h时间点胰腺组织病理学积分均显著低于SAP-NS组(P<0.01).

结论: p38 MAPK信号转导通路与牛磺胆酸钠大鼠SAP发病机制有关, CNI1493预处理可能通过抑制p38 MAPK的激活、减少炎症细胞因子的产生而改善胰腺炎病理改变的严重程度.

关键词: p38丝裂原活化蛋白激酶; 重症急性胰腺炎; 磷酸化

p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway in pathogenesis of severe acute pancreatitis in rats

Xin-Gang Shi, Zhao-Shen Li, Yi-Tao Jia, Yong-Chun Xu, Xiao-Hua Man, Yan-Fang Gong, Zhen-Xing Tu, Guo-Ming Xu

Xin-Gang Shi, Zhao-Shen Li, Yi-Tao Jia, Yong-Chun Xu, Xiao-Hua Man, Yan-Fang Gong, Zhen-Xing Tu, Guo-Ming Xu, Department of Gastroenterology of Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Correspondence to: Zhao-Shen Li, Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, 174 Changhai Lu, Shanghai 200433, China. zhsli@81890.net

Received: August 17, 2004
Revised: October 1, 2004
Accepted: October 11, 2004
Published online: March 1, 2005

Abstract

AIM: To study the dynamic changes of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) phosphorylation and to assess the effect of p38 MAPK phosphorylation inhibitor in severe acute pancreatitis (SAP) in rats.

METHODS: The SAP model was induced by bili-pancreatic duct retrograde infusion with 5% sterile sodium taurocholate solution. Eighty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham-operation (SO) group (n = 30), SAP-NS group (n = 25) and SAP-CNI1493 group (n = 25). In the SAP-CNI1493 group, SD rats were administered with 10 mg/kg inhibitor CNI-1493 (i. v.) 30 min before induction of SAP. In SAP-NS group, rats received same volume isotonic saline (i. v.) as CNI-1493. Pancreatic tissues and serum samples were collected before and 15 min, 0.5 h, 1 h, 3 h, 6 h after operation. Western blot analysis was performed to determine the phosphorylations of p38 MAPK in the pancreas homogenates. Serum levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by ELISA; Pathological changes of pancreas were examined and scored with light microscopy.

RESULTS: In the SO group, basal p38 MAPK phosphorylation was detected. In the SAP-NS group, the p38 MAPK phosphorylation in the pancreas homogenates reached the maximum at 15 min, remained at a similar level at 30, 60 and 180 min, and declined to the same level as that in SO group at 6 h. In the SAP-NS group and SAP-CNI1493 group, the densities of the band detected by Western blot were 5 200±360, 3 500±250 at 15 min, and 4 910±320, 2 500340 at 30 min (P <0.01). In SAP-CNI1493 group, the serum levels of IL-1β and TNF-α were decreased significantly as compared with those in SAP-NS group (P <0.01). The severity of tissue damage in the SAP-CNI1493 group at 3 h were significantly attenuated in comparison with that of the SAP-NS group (P<0.01).

CONCLUSION: The p38 MAPK plays an important role in the pathogenesis of SAP. Inhibition of p38 MAPK phosphorylation may be a potential approach for prevention and treatment of SAP.

Key Words: p38 MAPK; Severe acute pancreatitis; Phosphorylations

0 引言

重症急性胰腺炎(SAP)因其常可并发全身炎症反应综合征(SIRS)、全身多脏器功能障碍(MOF)及死亡率高达10%-30%而一直是学者们的研究热点. 近年来信号转导通路在发病机制中的意义更是引起人们的兴趣, 已经有研究显示蛙皮素大鼠轻症急性胰腺炎(MAP)造模后早期胰腺组织p38MAPK即大量磷酸化活化, 而p38MAPK特异性抑制剂能改善胰腺炎病变的严重程度[1-2]. 本研究检测50 g/L牛磺胆酸钠胆胰管内逆行注射诱导大鼠SAP模型胰腺组织p38MAPK磷酸化活化水平, 探讨p38MAPK信号转导通路特异性抑制剂CNI-1493对SAP的保护作用.

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠80只, 清洁级, ♂, 质量250-300 g, 购自第二军医大学实验动物中心, 本实验室适应性饲养1 wk开始实验, 大鼠造模前禁食12 h, 自由饮水. 牛磺胆酸钠(Simga公司); 胞质蛋白试剂盒(NE-PER Pierce公司); p38MAPK抑制剂CNI-1493(美国Pennsylvania州Cruz博士惠赠); 大鼠血清IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒(上海增健生物科技公司); p38MAPK磷酸化单克隆一抗(Cell Signaling Technology公司); 山羊抗小鼠IgG-HRP二抗(Immuclub Labs. Inc. CA. USA); ECL试剂盒(LumiGLO Chemiluminescent Substrate, Lake Placid, NY). 实验前2 h禁水. 随机分为假手术组(SO组, n = 30)、SAP生理盐水干预对照组(SAP-NS组, n = 25)及SAP-CNI1493干预组(SAP-CNI1493组, n = 25), SO组分0(正常对照组), 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 每时间点5只; SAP-NS组及SAP-CNI1493组分造模后15, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 每时间点5只.30 g/L戊巴比妥钠腹腔注射麻醉, 以4号加工钝头静脉针逆行穿刺十二指肠前壁、通过十二指肠乳头插入胆胰管远端, 分别在近肝门及胆胰管十二指肠开口处动脉夹将胆胰管两端钳闭, 以0.2 mL/min速度注入5%牛磺胆酸钠(1 ml/kg). SO组开腹后仅翻动十二指肠并触摸胰腺数次, SAP-CNI1493组于造模前30 min, 尾静脉注入CNI-1493(10 mg/kg), SAP-NS组注入相同体积的双蒸水. 各时间点腹主动脉取血处死大鼠, 并迅速取胰腺组织.

1.2 方法

常规石蜡包埋, 在不同平面切取两张切片行HE染色, 由专科医师光镜下观察胰腺组织病理变化, 参照Rongione et al(Gastroenterology 1997; 112: 960)标准进行评分. 血清TNF-α、IL-1β的测定采用ELISA方法测定. 胰腺组织100 mg翦碎后于液氮中研磨, 按照操作说明抽提胞质蛋白, 蛋白定量采用BCA法. 取40 μg样品常规进行SDS-PAGE电泳后, 电转移至硝酸纤维素薄膜, 50 g/L脱脂奶粉的1碩BST溶液室温封闭. 第一抗体为磷酸化p38MAPKmAb, 第二抗体为山羊抗小鼠IgG-HRP. ECL显色, 照片在Fluors Mutilmager图像分析仪(BioRad公司)上用Quantity One 4.1版图像分析软件进行分析, 以相应蛋白条带的平均光密度值来表示p38MAPK磷酸化活化水平的相对强度.

统计学处理 所有数据以mean±SD表示. 通过SPSS11.0统计软件, 采用单因数方差分析对各组均数进行显著性检验, P<0.05具有显著性差异.

2 结果

2.1血清TNF-α、IL-1β水平

SO组血清TNF-α, IL-1β水平在0, 3 h及6 h无显著性变化, 均低于其他组(P<0.01); SAP-NS组及SAP-CNI1493组血清TNF-α, IL-1β水平随造模后时间的延长而逐渐升高, 其中SAP-CNI1493组各时间点TNF-α, IL-1β水平均显著低于SAP-NS组(P<0.01, 表1).

表1 SAP大鼠血清TNF-α, IL-1β水平 (mean±SD, ng/L).

分组	TNF-α			IL-1β
	0	3 h	6 h	0	3 h	6 h
SO	60.3±15.2	65.8±20.5	66.3±21.2	90.3±20.2	85.8±25.5	95.3±27.2
SAP-NS		286.5±50.3b	500.5±45.3b		293.8±46.3b	388.0±44.5b
SAP-CNI1493		188.4±31.2	355.5±40.2		200.6±27.3	270.7±31.8

^bP<0.01vs SO, SAP-NS group.

2.2 胰腺组织病理学评分

SO组胰腺组织结构清晰, 腺泡小叶完整、无坏死、间质水肿和炎症细胞浸润. SAP-NS组3 h时间点胰腺组织可见间质水肿, 小叶间隙增大, 残余腺泡肿胀; 并可见片出血坏死和腺泡小叶结构破坏, 坏死区周围有大量的嗜中性白细胞及单核细胞等炎症细胞浸润. SAP-CNI1493组3 h时间点胰腺组织水肿、炎症、出血、坏死积分及总积分显著降低(P<0.01vs SAP-NS group, 表2).

表2 SAP 3 h大鼠胰腺组织病理学积分 (mean±SD, n = 5).

分组	水肿	炎症	出血	坏死	总积分
SAP-NS	3.3±0.2	2.3±0.2	1.6±0.1	2.7±0.2	9.9±0.4
SAP-CNI1493	2.7±0.2b	1.8±0.2b	1.1±0.2b	1.9±0.3b	7.5±0.3b

^bP<0.01 vs SAP-NS group.

2.3 胰腺组织p38MAPK磷酸化

SO组大鼠胰腺组织中检测到少量磷酸化p38MAPK的表达; SAP-NS组造模后15 min磷酸化p38MAPK的表达即显著增高至峰值, 维持3 h后显著下降(P<0.05), 6 h时磷酸化p38MAPK的表达与SO组相似(P>0.05).15 min及30 min时SAP-CNI1493组胰腺组织中磷酸化p38MAPK的表达显著低于SAP-NS组相应时间点(P<0.01, 表3).

表3 SAP大鼠胰腺组织磷酸化p38MAPKWestern blot光密度检测结果 (mean±SD, n = 5).

分组	0	15 min	30 min	1 h	3 h	6 h
SO	1 200±105	-	-	-	-	-
SAP-NS		5 200±360b	4 910±320b	4 300±230b	3 800±120b	1 300±140
SAP-CNI1493		3 500±250	2 500±340	-	-	-

^bP<0.01 vs SO, SAP-NS group.

3 讨论

近年来丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在SAP发病机制中的作用日益引起研究者们的重视, 其中p38MAPK是最主要、研究最深入的MAPK家族成员之一, 在机体应激和炎症反应调控过程中有极其重要的作用[3-5], p38MAPK信号转导通路可与NF-κB通路在下游聚合[6-8], 调控TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、E-选择素的产生. p38MAPK的激活在急性胰腺炎(AP)发生、发展起着极其重要的作用, Wagner et al(Digestion 1999; 60: 41)在雨蛙素MAP模型上发现, 造模后胰腺细胞的p38MAPK活性迅速升高, 30 min时活性达到峰值, 120 min时p38MAPK降至基础活性. Dabrowski et al[9]发现活性氧(ROS)可以显著激活MAP胰腺腺泡细胞内p38MAPK.

目前对p38 MAPK在AP发病机制中作用的研究主要集中于MAP模型和离体胰腺炎模型上, 对于具有更重要意义的SAP还缺乏系统的研究. 我们利用SAP大鼠模型, 发现SO组胰腺组织中能检测到磷酸化p38MAPK的弱表达, 造模后15 min时p38MAPK的表达即显著增高至峰值, 维持较高水平3 h后开始下降, 6 h时磷酸化p38MAPK的表达与SO组相似. SO组胰腺组织中存在磷酸化p38MAPK的基础表达, 说明p38MAPK信号转导通路可能参与调节胰腺腺泡细胞的基础生理活动, 是机体在基础应激状态下就活化的信号转导通路; 造模后早期胰腺组织的p38MAPK即显著活化, 提示p38MAPK信号转导通路在SAP发病的过程中参与了炎症信号转导, 对SAP的发生、发展可能具有重要的意义; SAP病理过程中p38MAPK活化维持较高水平的时间, 而且贯穿于胰腺炎整个早期病理过程, 长于以往研究报道的MAP模型中的维持较高活化水平时间[1-2], 从细胞信号转导水平上揭示了MAP和SAP发病机制可能存在差异. p38MAPK持续的激活可引起炎性细胞因子的不断产生, 而不断产生的炎性因子使炎症反应调控失衡导致级联"瀑布"效应, 并由此导致SIRS、MOF的发生[10]. 随着对p38MAPK信号转导通路病理生理功能及其在AP发病机制中作用研究的不断加深, 已经证实p38MAPK信号转导通路可以作为MAP时抗炎治疗的靶点, 抑制p38MAPK能够发挥有效的抗炎作用, 减少细胞因子、炎症递质等释放, 减轻胰腺腺泡细胞损伤, 明显提高动物的生存率, 并且未发现明显的毒副作用[11-13]. Blinman et al[14]发现, 体外胰腺炎时胰腺腺泡细胞p38MAPK活性明显升高, 并且与TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, MCP-1等多种细胞因子及趋化因子的产生有关, 而采用p38MAPK的抑制剂如SB-203580等能明显抑制上述细胞因子及趋化因子的产生, 抑制程度可达70%-95%, 并且抑制细胞因子及趋化因子的程度与抑制p38MAPK的程度成正比. 本研究结果提示CNI-1493能抑制炎性细胞因子IL-1β, TNF-α的过度产生, 因此p38MAPK的过度激活, 刺激炎症因子的过度激活可能是胰腺炎病理改变的一个重要机制. 本研究提示p38MAPK是SAP的发病机制中一条重要的信号转导通路, p38MAPK抑制剂可能通过调控炎症递质和细胞因子的产生而减轻SAP的病理改变的严重程度. 但本研究只是一个预防性给药, 着眼点还是在于机制的研究, 而且在本实验中未能分多个时间点和不同剂量、不同用药途径进行研究, 与真正的药理学研究还有一定的差距. 最近Ge et al[15]发现并不是MKK的蛋白也能调控MAPK的激活, 而且对p38MAPK在AP中的作用还有矛盾的报道, 如Fleischer et al[2]的研究发现p38MAPK抑制剂SB203580干预后出现胰蛋白酶水平升高、病理学上出现MAP时不应该出现的明显腺泡细胞坏死. 由于MAPK在炎症性疾病中作用的确切的机制仍未清楚, 因此p38MAPK信号转导通路活化及其抑制剂对SAP作用的具体机制还有待进一步深入和完善.

备注

编辑: 张海宁 电编: 潘伯荣

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