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世界华人消化杂志. 2005-08-15; 13(15): 1852-1855
在线出版日期: 2005-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i15.1852
大龄大鼠空肠平滑肌对异丙肾上腺素反应下降的机制
李敏, 李祖贵, 朱晓博, 冯秀玲, 胡还忠
李敏, 李祖贵, 朱晓博, 胡还忠, 华中科技大学同济医学院生理系 湖北省武汉市 430030
冯秀玲, 华中科技大学同济医学院机能学中心实验室 湖北省武汉市 430030
李敏, 男, 1983-06-07生, 江苏溧阳人, 华中科技大学同济医学院硕士在读生, 主要从事消化生理学的研究.
通讯作者: 胡还忠, 430030, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院生理系. huhuanzh@163.com
电话: 027-83630850
收稿日期: 2005-04-20
修回日期: 2005-05-02
接受日期: 2005-05-14
在线出版日期: 2005-08-15

目的: 观察不同月龄大鼠空肠平滑肌对b受体激动剂异丙肾上腺素(Iso)反应性的变化, 初步探讨其变化的机制.

方法: 采用灌流法加药, 利用张力换能器记录离体空肠平滑肌张力的变化.

结果: 20月龄组大鼠空肠平滑肌收缩频率都低于3月龄组(27.0±2.5 vs 30±3.1, P<0.05); 灌流10-9-10-6 mol/L终浓度的Iso后, 20月龄组大鼠空肠平滑肌收缩幅度变化的百分率(即舒张反应)都低于3月龄组(3×10-8, -41.4%, P<0.05;1×10-7, -34.6%, P<0.05;3×10-7, -25.0%, P<0.05;1×10-6, -19.5%, P<0.05); 加Nw-nitro-L-arginine(L-NNA)后, 3月龄组对Iso的舒张反应降低, 而20月龄组对Iso的舒张反应未见明显变化; 抑制NOS前, 20月龄组Iso的pD2值比3月龄组的pD2值小(6.52±0.54 vs 6.98±0.3, P<0.05).

结论: 大龄大鼠空肠平滑肌对Iso的反应性下降;NOS或一氧化氮(NO)的作用降低可能是引起大龄大鼠空肠平滑肌对Iso的反应性下降的重要原因之一.

关键词: 空肠平滑肌; b受体; 异丙肾上腺素; 一氧化氮
引文著录: 李敏, 李祖贵, 朱晓博, 冯秀玲, 胡还忠. 大龄大鼠空肠平滑肌对异丙肾上腺素反应下降的机制. 世界华人消化杂志 2005; 13(15): 1852-1855
Mechanism of decreased response of jejunal smooth muscle to isoproterenol in aged rats
Min Li, Zu-Gui Li, Xiao-Bo Zhu, Xiu-Ling Feng, Huan-Zhong Hu
Min Li, Zu-Gui Li, Xiao-Bo Zhu, Huan-Zhong Hu, Department of Physiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Xiu-Ling Feng, Central Laboratory of Functional Medicine, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Correspondence to: Huan-Zhong Hu, Department of Physiology, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China. huhuanzh@163.com
Received: April 20, 2005
Revised: May 2, 2005
Accepted: May 14, 2005
Published online: August 15, 2005

AIM: To investigate the response of jejunal smooth muscles (JSMs) to nonselective b-adrenoceptor agonist (Isoprot-erenol, Iso) in rats with different ages and its possible mechanism.

METHODS: The nonselective b-adrenoceptor agonist Iso and nonselective nitric oxide synthase (NOS) inhibitor Nw-nitro -L-arginine (L-NNA) were perfused into the baths of rat JSMs. Muscle force transducer (MFT) was used to measure the tension of JSMs.

RESULTS: The contractive frequency of JSMs was markedly lower in 20-mo rats than that in 3-mo rats (27.0±2.5 vs30±3.1, P<0.05). After perfusion with Iso (Final concentration: 1×10-9-1×10-6 mol/L), the variation rates of contractive amplitude of JSMs in 20-mo rats were lower than those in 3-mo rats (3×10-8 mol/L: -41.4%, P<0.05; 1×10-7 mol/L: -34.6%, P<0.05; 3×10-7 mol/L: -25.0%, P<0.05; 1×10-6 mol/L: -19.5%, P<0.05). After the administration of L-NNA, the relaxation responses of JSMs decreased in 3-mo rats, while there was no obvious variation in 20-mo rats. Before the administration of L-NNA, the pD2 of b-adrenoceptor decreased in 20-mo rats as compared with that in 3-mo rats (6.52±0.54 vs 6.98±0.30, P<0.05).

CONCLUSION: The response of JSMs to Iso in aged rats decreases, and the mechanism may be related to the decreased effect of NOS or nitric oxide.

Key Words: Jejunal smooth muscle; b-adrenoceptor; Soproterenol; Nitric oxide
0 引言

随着人口的老龄化, 老年性疾病越来越受到重视, 老年消化道疾病如吞咽困难, 便秘, 腹泻, 以及肠易激综合征等也越来越常见. 研究发现, 随着年龄的增长, 肠神经系统(ENS)神经元的数量也明显减少[1].b受体在大鼠肠道有着广泛分布, b受体兴奋后通过GS蛋白激活腺苷酸环化酶(AC), 催化ATP生成cAMP, 再通过使PKA磷酸化, 产生各种生理效应. 已有资料显示, 老年动物模型心肌、膀胱等组织中的b受体对异丙肾上腺素(Iso)反应性下降[2-4]. 但对老年大鼠小肠组织中b受体机能活动的变化的研究尚未见报道. 我们观察了不同年龄的SD大鼠空肠平滑肌对Iso舒张反应性的变化, 以及L-NNA(非选择性NOS抑制剂)对Iso浓度-效应曲线的影响, 并初步探讨了其变化的机制.

1 材料和方法
1.1 材料

Sprague-Dawley清洁级大鼠30只, 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供. 随机分成2组, 20月龄组15只, 最初月龄3 mo, 用同济医学院实验动物中心提供的条形饲料喂养至月龄为20 mo, 体重450-550 g. 对照组15只, 月龄3 mo, 体重150-250 g, 与20月龄组的喂养条件相同, 适应性喂养2 wk. 实验前禁食18 h, 自由饮水. 异丙肾上腺素(isoproterenol, Iso)由上海禾丰有限公司提供, N-硝基-L-精氨酸(Nw-nitro-L-arginine, L-NNA)由Sigma公司提供. KCl, MgCl2, CaCl2, NaHCO3, NaCl, KH2PO4均为国产分析纯试剂. MedlabU4CS生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司), JZ100型肌肉张力换能器(高碑店市新航机电设备有限公司), 超级恒温器(上海市实验仪器厂).

1.2 方法

大鼠击头致昏, 立即打开腹腔分离空肠, 取一段距胃幽门窦10 cm处的空肠, 制备成长0.6 cm的标本, 将离体空肠标本一端固定于肌槽底部的不锈钢丝固定钩上, 另一端通过挂钩接肌肉张力换能器, 后者与MedlabU4CS生物信号采集处理系统连接, 定量记录平滑肌张力的变化. 肌槽内盛Kreb液(mmol/L:NaCl 118.07, KCl 4.69, CaCl2 2.52, MgSO4 1.16, NaH2PO41.01, NaHCO3 25, glucose 11.10)10 mL, 持续通以950 mL/LO2和50 mL/L CO2的混合气. pH7.4, T 37±0.5 ℃.观察舒张率= [(加药前收缩幅度-加药后收缩幅度)/加药前收缩幅度]×100%. 收缩频率变化百分率 = [(加药前收缩频率-加药后收缩频率)/加药前收缩频率]×100%.

统计学处理 采用Microsoft Office Excel 2003软件进行数据统计. 实验数据以mean±SD表示, 两组间数据比较采用组间t检验, 组内比较采用配对t检验, 检验水准:a = 0.05, P<0.05为差异显著.

2 结果
2.1 大鼠空肠平滑肌自主收缩幅度和频率

将平滑肌标本置于Krebs液中平衡50 min, 自主收缩平稳后记录和比较2组动物空肠平滑肌的自主收缩频率波幅, 结果显示, 基础状态下的空肠平滑肌自主收缩频率20月龄组低于3月龄组, 而自主收缩波幅与3月龄组相比没有显著性差异(表1, 图1).

表1 Iso对大鼠空肠平滑肌自主收缩幅度的影响(n = 9).
分组基础
加Iso后(3×10-7mol/L)
变化百分率(%)
张力频率(次/min)张力频率(次/min)张力频率(次/min)
3月龄组1.2±0.530.3±3.10.16±0.13c26.2±3.6c84.80±15.113.6±10.0
20月龄组1.3±0.527.0±2.5a0.40±0.22ac26.4±2.477.94±15.6a2.5±2.6a
aP<0.05 vs 3月龄组;
cP<0.05 vs基础.
图1
图1 Iso10-7 mol/L对大鼠空肠平滑肌自主收缩波形曲线的影响.
2.2 大鼠空肠平滑肌对Iso的舒张反应

按半对数摩尔浓度法, 加入累积浓度的Iso, 使灌流槽内Iso终浓度依次为3×10-10, 1×10-9, 3×10-9, 1×10-8, 3×10-8, 1×10-7, 3×10-7和1×10-6 mol/L, 记录灌流不同浓度的Iso时平滑肌舒张的百分率. 与3月龄组相比, 终浓度高于3×10-8时20月龄组空肠平滑肌对Iso的舒张反应在各浓度点明显降低. 浓度为3×10-8 mol/L时, 20月龄组舒张率为15.9%, 较3月龄组降低41.4%(P<0.05); 在1×10-7 mol/L, 20月龄组舒张率为32.1%, 较3月龄组降低34.6%(P<0.05); 在3×10-7 mol/L, 20月龄组舒张率为56.7%, 较3月龄组降低25.0%(P<0.05); 在1×10-6 mol/L, 20月龄组舒张率为72.8%, 较3月龄组降低19.5%(P<0.05, 图2). 结果表明20月龄组大鼠空肠平滑肌对Iso的舒张反应在各个浓度点均较3月龄组下降.

图2
图2 大鼠空肠平滑肌对Iso的舒张反应. aP<0.05vs 3 mo+Iso.
2.3 Iso相对b受体的pD2(-logEC50)值的比较

3月龄组pD2值为6.98±0.3, 20月龄组为6.52±0.54, 20月龄组比3月龄组pD2值下降(P<0.05).

2.4 NOS抑制剂L-NNA对Iso引起的大鼠空肠平滑肌标本舒张反应的影响

标本平衡至收缩平稳后, 加入L-NNA, 终浓度为５×10-5 mol/L, 5 min后, 再按半对数摩尔浓度法, 加入不同浓度的Iso, 记录不同浓度时平滑肌舒张的百分率, 与未加L-NNA(Control)时相同浓度的Iso对平滑肌舒张的百分率进行比较. 加L-NNA后, 3月龄组大鼠空肠平滑肌标本对Iso的舒张反应在各浓度均明显降低. 加入L-NNA后, Iso的为3×10-8 mol/L时, 舒张率为16.0%, 舒张率较加药前降低41.2%(P<0.05); 在1×10-7 mol/L时为27.5%, 较加药前降低44.3%(P<0.05); 在3×10-7 mol/L时为56.4%, 较加药前降低25.4%(P<0.05); 在3×10-6mol/L时为78.8%, 较加药前降低12.8%(P<0.05, 图3). 结果表明, 3月龄组大鼠空肠平滑肌标本, 在抑制NOS后对Iso的舒张反应在各个浓度点均下降. 而20月龄组大鼠空肠平滑肌对各浓度点对Iso的舒张反应, 加L-NNA前后无明显差异(P>0.05). 用L-NNA抑制NOS后, 20月龄组同3月龄组空肠平滑肌标本对Iso的舒张反应也无明显差异(P>0.05).

图3
图3 L-NNA对Iso引起的3月龄组空肠平滑肌舒张反应的影响. aP<0.05 vs 3 mo+Iso.
3 讨论

Nishimoto et al[3]的研究表明, 随着年龄的增长, 豚鼠心肌细胞对Iso的收缩反应显著下降, 认为与AC(腺苷酸环化酶)通路的损伤有关;Birder et al[5]发现, 老年家兔膀胱逼尿肌对Iso的舒张反应显著下降, 可能由b受体表达和cAMP生成的减少所致. 我们的实验结果显示, 20月龄大鼠空肠平滑肌自主收缩幅度和频率同3月龄组相比相对下降, 其中频率降低显著; 不同浓度的Iso灌流大鼠空肠平滑肌后, 20月龄组收缩幅度和频率的变化百分率都低于3月龄组, 即20月龄组大鼠空肠对b受体激动剂(Iso)的反映性也下降. 同时, 20月龄组Iso对b受体的pD2值显著下降, 提示b受体对其激动剂的亲和力下降. 说明动物随年龄的增加, 除心脏, 膀胱外, 消化道平滑肌运动功能也有降低趋势, 对b受体激动剂的反应性也下降. 组织不同其运动功能减低的机制有可能不一样.

Kanai et al[6]发现心肌细胞b受体兴奋时, 可促进NO的生成. Banwait et al[7]和Varghese et al[8]分别观察到兴奋肛门内括约肌及心肌的b3受体, 引起NO的生成增加. Birder et al[5]认为, 兔膀胱内的肾上腺能神经元释放的去甲肾上腺素以及肾上腺髓质释放的儿茶酚胺, 通过兴奋膀胱上皮上的b受体后, 促进NO的生成而影响膀胱的功能, 其促进NO的生成机制可能为b受体通过AC途径促使细胞内Ca2+的释放所致. 消化道平滑肌的运动受到高级中枢神经系统、自主神经系统、内在神经系统、自身及体液等调节. 胃肠道除受交感和迷走神经支配外, 还存在NANC能神经的支配, 其神经递质可能为NO[1,9-11].NO由L-精氨酸经NOS催化合成. NOS是NO产生的限速酶, 有3种类型, 即神经型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱导型NOS(iNOS). 其中nNOS与eNOS合称为结构型NOS(cNOS), 依赖于钙-钙调蛋白而起作用. NO对胃肠道的运动起着重要的调节作用[6,8]. 我们以往的工作表明[12-14], L-精氨酸对小肠平滑肌有抑制作用, 这种作用与NOS的活性有关, 而NOS的活性又受a、b受体机能状态的影响, 而非NA、Iso的直接作用.

本实验结果表明, 大龄大鼠空肠平滑肌自主收缩幅度和频率下降和对b受体激动剂(Iso)的反应减弱与NO有关. NOS抑制剂L-NNA使3月龄组空肠平滑肌对Iso的舒张反应的幅度降低、Iso浓度-效应曲线向右下移动提示, L-NNA阻断NOS后, NO合成减少, 使Iso对空肠平滑肌的舒张作用明显减弱, 说明NO参与了Iso对年轻大鼠空肠平滑肌的舒张作用. Iso对20月龄组大鼠空肠平滑肌标本的舒张作用较小; 给与L-NNA前后Iso对空肠平滑肌标本的舒张作用无明显变化, 对Iso的浓度-效应曲线也无明显影响. 因此, 有理由认为, 20月龄组大鼠空肠平滑肌除b受体对其激动剂的亲和力下降外, NOS活性降低或NO的合成减少也可能是引起大龄大鼠空肠平滑肌对Iso的反应性下降的重要原因之一; 还可能与sGC的活性降低及其与NO的亲和力下降有关. 此机制可能在老年性胃肠道运动功能障碍的发病中起重要作用. 但大龄大鼠空肠平滑肌对Iso的反应性下降的确切机制和临床意义有待进一步研究.

编辑:潘伯荣 审读:张海宁

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