基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2005-01-01; 13(1): 39-43
在线出版日期: 2005-01-01. doi: 10.11569/wcjd.v13.i1.39
实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义
张冬雷, 施健, 崔之础, 王惠民, 鞠少卿, 李立人, 倪红兵, 苏建友
张冬雷, 施健, 崔之础, 南通大学附属医院酶学研究室 江苏省南通市 226001
王惠民, 鞠少卿, 倪红兵, 苏建友, 南通大学附属医院检验医学中心 江苏省南通市 226001
李立人, 南通大学附属医院消化内科 江苏省南通市 226001
张冬雷, 男, 1976-01-21生, 江苏省南通市人, 汉族, 分子生物学专业硕士研究生, 讲师, 主要从事病毒和肿瘤免疫学研究.
通讯作者: 崔之础, 226001, 江苏省南通市西寺路20号, 南通大学附属医院酶学研究室. zdonglei@yahoo.com.cn
电话: 0513-5052483 传真: 0513-5052102
收稿日期: 2004-11-01
修回日期: 2004-11-07
接受日期: 2004-11-12
在线出版日期: 2005-01-01

目的: 建立实时荧光定量RT-PCR(RFQ-RT-PCR)检测HCV RNA含量的方法, 初步探讨HCV RNA含量变化与病情的相关性.

方法: HCV抗体阳性样本80例, 包括慢性肝炎(CH)39例, 肝硬化(LC)23例, 肝癌(HCC)18例, 献血员样本40例为正常对照. 在HCV基因组5'非编码区(5'UTR)设计特异性引物和一对杂交探针, 构建相应基因片段载体, 体外转录RNA作为标准品, 根据其建立的标准曲线对血清HCV RNA进行定量, 同时用传统的套式RT-PCR进行定性分析.

结果: 本法检测HCV RNA含量的线性范围为1012-104copies/L, 批内和批间重复性测定的v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%. 在HCV抗体阳性患者中, 肝硬化和肝癌患者的HCV RNA含量显著高于慢性肝炎患者(7.75±0.29, 7.86±0.32 vs 4.67±0.41, P<0.05), 而且HCV RNA含量与ALT水平呈正相关(r = 0.89, t = 8.29, P<0.05).

结论: RFQ-RT-PCR检测HCV RNA含量具有较好的灵敏度和特异性, 其含量与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性.

关键词: HCV RNA含量; 实时荧光定量检测
引文著录: 张冬雷, 施健, 崔之础, 王惠民, 鞠少卿, 李立人, 倪红兵, 苏建友. 实时荧光定量检测HCV RNA含量的临床意义. 世界华人消化杂志 2005; 13(1): 39-43
Clinical significance of HCV RNA loads quantified by real-time fluorescence quantitative reverse transcription-PCR
Dong-Lei Zhang, Jian Shi, Zhi-Chu Cui, Hui-Min Wang, Shao-Qing Ju, Li-Ren Li, Hong-Bing Ni, Jian-You Su
Dong-Lei Zhang, Jian Shi, Zhi-Chu Cui, Enzymological Laboratory, Affiliated Hospital of Nangtong University, Nangtong 226001, Jiangsu Province, China
Hui-Min Wang, Shao-Qing Ju, Hong-Bing Ni, Jian-You Su, Center of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Nangtong University, Nangtong 226001, Jiangsu Province, China
Li-Ren Li, Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Nangtong University, Nangtong 226001, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Zhi-Chu Cui, Enzymological Laboratory, Affiliated Hospital of Nangtong University, 20 Xisi Road, Nangtong 226001, Jiangsu Province, China. zdonglei@yahoo.com.cn
Received: November 1, 2004
Revised: November 7, 2004
Accepted: November 12, 2004
Published online: January 1, 2005

AIM: To establish real-time fluorescence quantitative reverse transcription- polymerase chain reaction (RFQ-RT-PCR) for quantification of HCV RNA, and to explore the relationship between HCV RNA loads and disease progress.

METHODS: A total of 80 patients with anti-HCV positive were studied, including 39 with chronic hepatitis, 23 with liver cirrhosis and 18 with hepatocellular carcinoma. Forty samples from blood donors were used as normal controls. The specific primers and hybridization probes were designed in 5' untranslated region of HCV genome, and the corresponding gene fragment was cloned into pGEM-T vector to gain the RNA standards in vitro. According to the curve created based on RNA standards, serum HCV RNA was quantified by RFQ-RT-PCR, and was also qualified by nested RT-PCR simultaneously.

RESULTS: The detected range of HCV RNA by RFQ-RT-PCR was from 1012 to 104copies/L, and the coefficient of variation values for both intra-experimental and inter-experimental reproducibility ranged from 1.68%, 6.40% to 5.97%, 10.58%, respectively. The mean loads of HCV RNA in liver cirrhosis and hepatocelluar carcinoma patients were significantly higher than those in chronic hepatitis patients (7.75±0.29, 7.86±0.32 vs 4.67±0.41, P < 0.05), and there was also a positive correlation between HCV RNA loads and ALT level (r = 0.89, t = 8.29, P < 0.05).

CONCLUSION: RFQ-RT-PCR assay has good sensitivity and specificity in detection of HCV RNA loads, and HCV RNA loads may be associated with the progress and severity of disease state.

Key Words: HCV RNA loads; Real-time fluorescence quantitative reverse transcription-PCR
0 引言

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)属黄病毒家族的正链RNA病毒, 是引起输血后肝炎的主要病原之一, 常呈无症状的持续感染, 约60%的感染者会演变成肝硬化和肝癌, 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关[1-17]. HCV抗体检测已不能用来作为评价疾病预后和判断抗病毒治疗效果的指标, 而病毒含量能真实反映其在体内的复制情况, 高滴度病毒含量患者对治疗的反应不敏感, 而且疗程也较长[18-19], 因此对血清中HCV RNA进行定量就显得十分重要, 将有助于判断疾病预后, 选择治疗方案及监测治疗效果等. 我们利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理, 在HCV基因组5'非编码区(5'UTR)区设计特异的引物和一对杂交探针, 建立了实时荧光定量(real-time fluorescence quantitative RT-PCR, RFQ-RT-PCR)方法, 并分析了80例临床样本HCV RNA含量如下.

1 材料和方法
1.1 材料

我院传染科和南通市传染病医院住院ELISA测得HCV抗体阳性样本80例, 包括慢性肝炎(chronic hepatitis, CH)39例, 肝硬化(liver cirrhosis, LC)23例, 肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)18例. 正常对照为我院输血科献血员样本40例. 血清于抽血后1 h内分离, 分装置-70 ℃保存. pGEM-T载体、大肠杆菌DH5α(E. coli DH5α)、Trizol购自Invitrogen公司, 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒为上海华舜生物工程公司产品, IPTG, X-gal, AMV, dNTPs, pfu DNA聚合酶购自Promega公司, 体外转录试剂盒、毛细管由Roche公司提供, Onmiscript逆转录试剂盒为QIAGEN公司产品. 根据HCV全序列[20](注册号AB114136), 应用Beacon Designer2.1软件, 设计如下引物和探针, 并由上海生工生物工程公司合成. HCV-S:5'-AACTACTGTCTTCACGCAGAAAGC -3'(nt52-nt75); HCV-AS:5'CCCTATCAGGCAGTACCACAAG-3'(nt300-nt279); HCV-P1:5'GCAGCCTCCAGGACCCCCC- Fluorescein-3'(nt106-nt124); HCV-P2:5'-LC Red 640-CCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTG-3'(nt127-nt149).

1.2 方法

Trizol法(按说明书操作)提取血清HCV RNA, 核酸蛋白紫外分析仪(Eppendorf公司)检测RNA的质量和浓度, 并进行逆转录反应, 体系含(1碦T Buffer, 0.5 mmol/L dNTPs, 1 μmol/L oligo-dT引物, RNase抑制剂10 U, RT酶4 U), 37 ℃ 1 h, 65 ℃ 15 min灭活逆转录酶, cDNA置-20 ℃保存. 取上述cDNA 2 μL, 用引物HCV S和HCV AS, 于PE9600进行PCR扩增目的片段. 经胶回收的PCR电泳产物3 μL(约20 ng)与PGEM-T载体4 ℃连接12-16 h. 连接产物转化感受态E. coli DH5α, 涂布于含X-gal和IPTG并具Amp抗性的15 g/L琼脂平皿上, 37 ℃倒置培养12-16 h, 经蓝白斑筛选, EcoRⅠ酶切初步鉴定, 阳性克隆进行测序分析(由上海博亚公司完成). 将筛选出的阳性菌株进一步扩增, 抽提质粒, SacⅠ酶切使质粒线性化, T7 RNA聚合酶体外转录cRNA(按试剂盒说明书操作), 37 ℃2 h, DNaseⅠ消化15 min, 0.2 mol/L EDTA终止反应, 纯化后用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定5次, 每次重复4管, 取均值), 并进行10倍系列稀释, 分装做为HCV RNA定量标准品-20 ℃保存. 套式PCR定性检测临床样本HCV RNA方法参见文献[21]. 临床样本血清HCV RNA含量测定: 血清100 μL, Trizol法提取HCV RNA. 将RNA模板2 μL加入RT-PCR反应液(含1×PCR Buffer, 5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTPs, HCV上下游引物各0.2 μmol/L, HCV-P1、HCV-P2荧光探针各0.1 μmol/L, 0.5 g/L BSA, AMV 10 U, pfu DNA聚合酶1 U)18 μL, 混匀后加入Roche专用毛细管中, 并设空白管、阴性对照和HCV RNA 6个标准品对照(浓度分别为1011、1010, 109, 108, 107, 106 copies/L). 各反应管于Roche荧光定量检测仪(Lightcycler)进行RT-PCR扩增: 42 ℃ 25 min, 93 ℃预变性2 min, 然后93 ℃ 5 s, 60 ℃ 10 s, 72 ℃ 10 s, 温度转换率为20 ℃/s, 共45个循环. 根据HCV RNA标准品建立的标准曲线, 由软件自动计算出待测样本中HCV RNA的准确含量.

统计学处理 应用Stata7.0统计分析软件对样本数据进行t检验, 并变异系数(v), 所得结果表示为均数±标准差(mean±SD), 显著性差异的概率设为P<0.05.

2 结果
2.1 RFQ-RT-PCR的建立

以RNA标准品为模板, HCV S、HCV AS为引物, 经Lightcycler扩增应得249 bp长的目的片段, 经15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合(图1). 经胶回收的PCR电泳产物与pGEM-T载体连接后, 转化感受态E. coli DH5α, 获得重组质粒, EcoRⅠ酶切初步鉴定(图2), 并经测序证实与NCBI的基因序列完全一致. 将HCV RNA标准品10倍系列稀释, 用建立的荧光定量PCR测定, 结果(图3)显示本法的线性范围为1012-104copies/L, 具有较好的检测灵敏度. 标准曲线显示Ct(threshold cycle)值和模板启始浓度的log值之间具有较好的线性关系(slope = 3.52, r = 1.00). 将系列稀释的HCV RNA标准品, 用荧光定量PCR重复测定10次, 每次每个稀释度重复3管, 结果(表1)显示本法的批内和批间重复性均较好, v分别为1.68-5.97%和6.40-10.58%.

表1 RFQ-RT-PCR的批内和批间重复性测定.
RNA Standard (copies/L)Intraexperimental Variability
Interexperimental Variability
χ2(log)SDv(%)χ2(log)SDv(%)
10118.210.394.758.140.617.49
10107.030.182.567.110.578.02
1095.950.101.686.090.396.40
1084.980.091.815.170.428.12
1074.120.153.644.230.388.98
1063.180.195.972.930.3110.58
图1
图1 电泳检测PCR扩增产物. M: DL2000 marker; 1-7: 1012-106 copies/L; 8: Negative control.
图2
图2 重组质粒酶切鉴定. M: DL2000 marker; 1: Recombinant vector; 2:Recombinant vector/inserted fragment.
图3
图3 RFQ-RT-PCR灵敏度测定. A:The detection limit of RFQ-RT-PCR was 104 copies/L; B: The linear relation between cycle and log concentration of HCV RNA was showed by standard curve (r = 1.00).
2.2 临床样本检测

用套式PCR和荧光定量PCR检测, 献血员40例样本结果均为阴性, HCV抗体阳性LC和HCC患者HCV RNA含量均显著高于CH(P<0.05, 表2), 提示HCV RNA含量可能与病情严重程度有一定关联. 对20例患者进行了随访, 分别于住院日(0 d)和住院后5 d, 15 d, 30 d, 60 d, 90 d检测肝功能(以ALT为主要观察指标)和HCV RNA含量, 结果提示, HCV RNA含量与病情(ALT水平)呈正相关(r = 0.89, t = 8.29, P<0.05, 图4).

表2 临床样本检测结果(mean±SD).
分组nNested RT-PCR Positive n (%)RFQ-RT-PCR
Positive n (%)Mean HCV RNA load(Log)
CH3938(97.4)37(94.9)4.670.41
LC2322(95.7)21(91.3)7.750.29a
HCC1818(100)18(100)7.860.32a
aP<0.05 vs CH.
图4
图4 HCB RNA含量与ALT相关性.
3 讨论

HCV是输血后非甲非乙型肝炎的主要病原, 85%感染者病情趋于慢性化, 有一部分演变成肝硬化甚至肝癌[1-12], 是严重威胁人民健康的传染病之一. 目前, HCV抗体检测已成功地应用于临床, 并在发现慢性HCV感染者方面发挥了巨大作用, 但在HCV急性感染后, 出现血清转换前的窗口期, 抗体检测可能是阴性, 而且直接检测HCV抗原的免疫测定目前还没有. HCV的两个主要病毒标志-HCV基因型和病毒含量有助于对疾病预后和抗病毒药物的疗效观察[22-23]. 因此, 对HCV进行定量, 有助于真实了解体内病毒复制情况, 对临床诊断, 判断预后, 合理用药都有巨大指导意义. 基于分枝DNA(bDNA)技术建立起来的HCV定量方法, 因其具有较好的准确性和重复性, 而被临床广泛采用, 但其敏感性较低[24-25]. RT-PCR法检测HCV RNA技术操作繁琐耗时; 产物必须经电泳或杂交(southern, ELISA)检测, 容易引起交叉污染而出现假阳性; PCR产物量易受到反应体系中其他成分浓度的影响, 定量不准确, 重复性较差[26-30]. 我们根据荧光共振能量转移(FRET)基本原理, 结合PCR技术高灵敏的优点, 在HCV高度保守的5'UTR区设计了一对杂交探针, 建立了实时定量检测HCV RNA含量的方法, 与Taqman定量方法相比灵敏度相当, 特异性更好, 避免了HCV基因型不同对定量检测结果的影响[31]. 将PCR的敏感性与探针杂交的特异性相结合, 在很大程度上改变了传统PCR的缺陷, 降低了反应时间, 简化了操作步骤; 闭管检测不需PCR后处理, 避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染; 实时检测技术可连续不断地检测PCR过程中荧光信号的变化, 避免了传统PCR的"平台期效应"; 使用的RNA标准品与模板RNA一起进行RT-PCR, 消除了逆转录反应对定量结果的影响, 而且对模板的定量不通过终产物, 而由Ct值计算出, 准确性和灵敏度均有提高. 对80例临床样本和40例献血员样本的检测结果显示, 本法与套式定性PCR阳性率相当, 适合临床应用; 初步研究结果还提示HCV RNA含量可能与丙型肝炎患者的病情变化及严重程度有一定相关性, 这将有助于临床判断HCV感染病情和疾病预后、选择治疗方案及监测抗病毒治疗效果等, 为进一步探讨HCV RNA含量与临床表现、生化改变及组织病理关系的研究奠定了基础.

编辑: 潘伯荣 审读: 张海宁

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