抑癌基因p27Kip1及其 Ser10突变体对HepG2细胞周期和增生的影响

摘要

目的: p27^kip1 氨基端第10号位置的丝氨酸(Ser¹⁰)磷酸化位点是该蛋白分子中最重要的磷酸化位点, 探讨人工诱变该位点丝氨酸为丙氨酸(S10A)后对肝癌细胞株HepG₂细胞周期以及细胞增生的影响. 同时比较野生型p27^kip1和Ser¹⁰突变型p27^kip1基因转染对肝癌细胞株HepG₂细胞周期和增生的影响.

方法: 应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27^kip1质粒DNA瞬时转染HepG₂细胞, 免疫细胞化学检测p27^kip1蛋白的表达和细胞内分布, 流式细胞计数仪分析细胞周期变化.

结果: 野生型和突变p27^kip1 蛋白转基因后HepG₂细胞均可以G₀期阻滞, 且突变型的阻滞作用强于野生型(P <0.05), 细胞生长受到抑制. 无血清培养96 h同步化于G₀期, 野生型和突变型p27^kip1均分布于细胞核; 而在20 mL/L血清继续培养8 h后野生型向细胞质转运而主要分布于细胞质, 突变型仍然滞留于细胞核.

结论: p27^kip1 的过度表达可明显抑制HepG₂细胞的增生, p27^kip1Ser¹⁰磷酸化可能介导其细胞核外转运的重要分子机制.

关键词: N/A

Role of phosphorylation of ser¹⁰ of p27^Kip1 in its subcellular localization in HepG₂ cell lines

Xiao-Xiang Guan, Long-Bang Chen, Ai-Hua Zhang, Jian-Hua Wang, Wei De

Xiao-Xiang Guan, Long-Bang Chen, Jian-Hua Wang, Department of Oncology, General Hospital of Nanjing Military Command Area, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China

Ai-Hua Zhang, Institute of Pediatrics, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Wei De, Department of Molecular Biochemistry, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China

Correspondence to: Xiao-Xiang Guan, Department of Oncology, General Hospital of Nanjing Military Command Area, Nanjing 210002, Jiangsu Province, China. xxguan@hotmail.com

Received: March 19, 2004
Revised: April 9, 2004
Accepted: April 29, 2004
Published online: September 15, 2004

Abstract

AIM: To investigate the influence of over-expression of exogenous p27^kip1 gene on cell cycle and proliferation in HepG₂ cell line, and to elucicate the role of phosphorylation of ser¹⁰ of p27^kip1 protein in its subcellular localization.

METHODS: Both plasmids containing the wild type and S10A p27^kip1 were transfected into HepG₂ cell lines with Lipofectamine separately. The exogenous p27^kip1 protein expression and subcellular localization was monitored with immunoflurescence under laser confocal microscope. Its biological effects on cell cycle and proliferation were determined by FACS and growth curves.

RESULTS: Over-expression of p27^kip1 protein was observed in transfected cells. As a result, the proliferation of HepG₂ cells was greatly inhibited and cell cycle was arrested in G₁ phase after exogenous p27^kip1 expression. Both the wild type and S10A p27^kip1 protein were distributed in the nucleus when synchronized at G₀ phase by serum deprivation for 96 hours. The wild type p27^kip1 protein was translocated from nucleus to cytoplasm when the cell was restimulated by exposure to 20% serum for 8 h, whereas the S10A p27^kip1 still presented in the nucleus.

CONCLUSION: The overexpression of p27^kip1 can inhibit the proliferation of HepG₂, and phosphorylation of p27^kip1 on serine¹⁰is required for its nuclear export.

Key Words: N/A

0 引言

肝细胞癌是人类常见的一种恶性肿瘤, 其发病机制则是目前人们研究的重点. 肝细胞癌的生物学特征就是多种原癌基因的激活、抑癌基因的失活及一系列复杂的调控机制失常所导致的失控性生长[1-8]. 失控性生长的主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增生过多和凋亡过少, 而p27^kip1作是一种重要的细胞周期素依赖性激酶的抑制因子, 是最有效的G₁阻断剂[9]. p27^kip1的蛋白表达水平及活性的改变与肿瘤的形成有关, 在肝细胞肝癌等多种肿瘤组织中表达降低[10]. 因此, 调节p27^kip1蛋白可能成为肿瘤生物治疗一个值得探讨的新靶点. 我们探讨p27^kip1及其突变体S10A过度表达对肝癌细胞周期的改变及其凋亡的影响, 并进一步分析其分子机制.

1 材料和方法

1.1 材料

野生型和S10A突变型人p27^kip1全长序列的cDNA由日本Kyushu大学Keiichi Nakayama 教授馈赠, 该载体在p27^kip1基因上游包含了FLAG蛋白, 从而形成p27^kip1/FLAG融合蛋白. 鼠源性的抗FLAG蛋白的抗体(M2)购自美国Sigma公司, FITC标记的羊抗鼠IgG 购自美国Santa Cruz公司. 质粒纯化试剂盒购自美国罗氏公司, Lipofectamine (LF2000) 购自美国Gibco 公司. 将日本Kyushu(九州大学)分子和细胞生物学中心Keiichi Nakayama教授国外馈赠的含有p27^kip1全长序列的cDNA转化到DH5a大肠杆菌感受态菌中, 氨苄青抗生素筛选后, 挑取单个克隆在含100 mg/L的Amp的LB培养基内37 ℃, 200 r/min过夜培养, 质粒抽提试剂盒抽提后用7 g/L的琼脂糖凝较电泳2 h鉴定Mr . 基因测序证明开放性阅读框架及氨基酸序列正确无误.

1.2 方法

HepG₂细胞培养用含100 mL/L小牛血清DMEM培养37 ℃、50 mL/L CO₂标准条件下培养. 转化前24 h, 以1.25 g/L 胰酶消化细胞, 2×10⁵每孔浓度接种6孔板. 转化采用采用脂质体(Lipofectamine 2000)法, 将5 mg质粒DNA和脂质体10 mL分别加入无FCS的DMEM培养剂100 mL中, 再将以上两种液体轻轻混匀, 室温静置20 min, 摇匀后, 滴加至6孔板的每1孔, 标准条件下培养4-6 h后更换新鲜完全培养液继续培养. 细胞分两组, 一组在培养48 h后, 用流式细胞仪分析细胞周期. 另外一组在转染24 h后以1 mL/L血清培养基培养96 h使其同步化G₀期, 然后再以含200 mL/L小牛血清培养基培养8 h, 使细胞进入S期, 激光共具焦显微镜观察以上两期p27^kip1分布改变. 细胞基因转染后在标准条件下培养48 h, 用1 g/L胰蛋白酶消化后收集细胞, 将细胞用PBS制成2×10⁸/L的单细胞悬液, 7 001 mL/L乙醇固定16 h, 加少量RNA酶和10 g/L碘化丙啶孵育30 min, 应用流式细胞仪FACS(美国Becton-Dickinson公司)进行细胞周期分析. 转化细胞以3×10⁵/孔的密度种于6孔板, 按实验设计的要求处理细胞后, 丙酮固定, 加入1:300稀释的抗FLAG mAb, 37 ℃结合1 h, 0.1 mol/L的PBS洗3次, 每次10 min, 再与FITC标记的羊抗鼠IgG(1:1 000) 37 ℃孵育30 min, 再以0.1 M的PBS洗三次后封片. 激光共聚焦显微镜下观选择488 nm观察p27^kip1蛋白的分布. 1×10⁵沉淀细胞中用1ul/ml的Hoechst33258染色, 37 ℃染色10 min, 荧光显微镜下观察, 蓝色荧光均匀者为正常细胞, 而核染色质浓集或成团者为凋亡细胞[11]. 以细胞动态计数来分析细胞增生状况, 每组设3复孔, 分别在基因转染后24, 48及72 h收集细胞计数并描绘生长曲线. 每组试验结果采用SPSS10.0统计软件分析. 所得数据以mean±SD表示, P <0.05为差异有显著性.

2 结果

2.1 p27^kip1基因转化对HepG₂细胞周期的影响

流式细胞仪分析显示, 野生型和S10A突变型人p27^kip1基因转染的HepG₂ 48 h后, 44.3%的未转化细胞处于G₀/G₁期, 而野生型和S10A突变型转细胞处于G₀/G₁期分别为59.7%和62.1%. 表明野生型和S10A突变型外源性p27^kip1蛋白在HepG₂细胞高表达可抑制细胞由G₁期向S期过度. 组间差异非常显著(P <0.01), 而两转化组间差异亦显著(P <0.05). 此外两组转染p27^kip1基因后的HepG₂出现凋亡峰(图1). Hoechst33258染色荧光显微镜下可见部分凋亡细胞核染色质浓集或成团者分布(图2). 提示过度表达p27^kip1蛋白可能促进HepG₂细胞凋亡.

图1 流式细胞仪分析比较转化p27^kip1基因对HepG₂细胞周期的影响.

图2 Hoechst33258染色比较转染p27^kip1基因对HepG₂细胞凋亡的影响.

2.2 转化细胞中p27^kip1的表达及分布

应用激光共聚焦显微镜观察发现转染细胞内有, 无血清培养基孵育96 h细胞阻滞G₀期, 野生型和突变型p27^kip1蛋白均主要分布细胞核(图3), 而在200 mL/L血清刺激后野生型p27^kip1分布细胞质, S10A突变型p27^kip1仍然分布于细胞核(图4).

图3 HepG₂细胞转化p27^kip1基因24 h后无血清培养96 h外源性p27^kip1细胞内的分布.

图4 p27^kip1基因转化的HepG₂细胞无血清培养96 h后200 mL/L血清刺激8 h外源性p27^kip1细胞内分布.

2.3 实验组细胞生物学性状的变化

对照组细胞增生旺盛, 镜下可见较多核分裂相, 倍增快; 而实验组细胞的增生停滞, 镜下看不出分裂的迹象, 细胞形态变大, 核浆比减小. 随着培养时间的延长, p27^kip1转化组细胞增生明显慢于空载体对照组(P <0.01, 图5)

图5 p27^kip1基因转染的HepG₂细胞增生情况.

3 讨论

p27^kip1蛋白是一种细胞周期调控的抑制因子, 与多种肿瘤发生、发展和预后密切相关[12-13]. 在肿瘤细胞p27^kip1蛋白通常地表达或无表达, 而过度表达则抑制肿瘤细胞过度增生. 我们也证实p27^kip1转染肝癌细胞株HepG₂后生长明显抑制, 流式细胞仪也出现凋亡峰, 提示p27^kip1转染后过度表达可能诱导细胞的凋亡, 在乳腺癌细胞株MDA-MB-231[14]和食管癌裸鼠模型的研究也发现p27^kip1过度表达可以促使细胞凋亡.

p27^kip1基因是高度保守的抑癌基因, 其与其他抑癌基因如p53的高突变率不同, p27^kip1基因少有或没有突变[15]. 关于S10A突变型p27^kip1蛋白对细胞周期调控的影响目前尚未有报道. 本文首次发现S10A突变型p27^kip1同样可以促进细胞周期阻滞于G₀, 而且强于野生型. 该研究似乎提示S10A突变是一个无义突变, 该突变对p27^kip1蛋白本身功能影响意义不明显. 然而, Ser¹⁰的磷酸化占总蛋白几乎70%, 可能是最主要的功能调节机制[15]. p27^kip1蛋白细胞周期G0/G1阻滞的主要分子[9], 而p27^kip1蛋白发挥其生物学功能除了依赖其表达水平还与其在细胞内分布密切相关[16], 细胞周期G0/G1阻滞时p27^kip1蛋白主要分布于细胞核, 而在M和S期开始时, 则由胞核穿过核膜进入细胞质. 我们发现S10A突变型p27^kip1不能由细胞核向细胞质转运, 提示p27^kip1蛋白主要分布细胞核, 而丧失了向胞质转运的功能. 而S10A突变型p27^kip1在细胞核滞留似乎更有利于其发挥细胞周期G₀/G₁阻滞, p27^kip1蛋白在细胞核的分布是其发挥细胞G₁期阻滞的分子基础.

细胞周期的不同时相, p27^kip1存在精确的细胞内亚定位调控机制, 但确切的分子机制并没有阐明. 我们发现S10A突变型p27^kip1丧失了由细胞核向细胞质转运功能, 说明Ser¹⁰磷酸化可能是介导其细胞核外转运的重要分子基础. 国外最新研究也证实p27^kip1蛋白可以和CRM1蛋白相互作用, 并且这种作用是依赖Ser¹⁰磷酸化[17], 而CRM1是一种广谱的核外运蛋白(exportin), 可以介导p27^kip1蛋白的细胞核外转运[18].

阐明p27 ^kip1分子的生物学特性及其在肝癌细胞周期调控中的作用, 在理论可以为进一步认识肝癌细胞增生失控的分子机制, 并为临床治疗提供新的思路.

备注

$[Footnotes]

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