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世界华人消化杂志. 2004-06-15; 12(6): 1365-1368
在线出版日期: 2004-06-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i6.1365
人HMGB1 A box和B box cDNA的克隆与表达
张艳, 何凤田, 李蓉芬, 连继勤, 杨朝辉, 高会广
张艳, 何凤田, 李蓉芬, 连继勤, 杨朝辉, 高会广, 中国人民解放军第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室 重庆市 400038
张艳, 女, 1978-02-09生, 重庆市人, 汉族. 2002年中国人民解放军第三军医大学硕士研究生, 主要从事肿瘤分子生物学方面的研究.
通讯作者: 何凤田, 400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学基础部生化与分子生物学教研室. tmmubiozy@yahoo.com.cn
电话: 023-68752263 传真: 023-68753462
收稿日期: 2004-03-05
修回日期: 2004-03-13
接受日期: 2004-03-18
在线出版日期: 2004-06-15

目的: 克隆人HMGB1中的A box (1-85 aa)和B box (88-162 aa)的cDNA, 构建重组原核表达载体并对其诱导表达, 为检测其生物学活性做准备.

方法: 提取人新鲜扁桃体组织总RNA, 经RT-PCR扩增出人 HMGB1 A box和B box 的 cDNA 序列, 并分别克隆至载体pUC19进行序列测定, 随后分别构建于高效原核表达载体pQE-80L/DHFR中, 经IPTG诱导 4 h后, 可表达Mr 约 35 000, 34 000的融合蛋白. Western Blotting鉴定所表达的目的蛋白.

结果: 经RT-PCR扩增得到了255 bp和225 bp的DNA片段, 经序列分析与GenBank中报道的已知序列完全一致, 构建了含融合蛋白的重组表达质粒, 诱导表达了目的蛋白, 经Western Blotting证实, 在Mr分别约为35 000和34 000处有两条清楚的蛋白带.

结论: HMGB1 A box和B box cDNA的克隆, 原核表达载体的构建及目的蛋白的表达鉴定, 为进一步研究HMGB1 A box和B box的生物学功能奠定了基础.

关键词: N/A
引文著录: 张艳, 何凤田, 李蓉芬, 连继勤, 杨朝辉, 高会广. 人HMGB1 A box和B box cDNA的克隆与表达. 世界华人消化杂志 2004; 12(6): 1365-1368
Cloning and expression of HMGB1 A box and B box cDNAs
Yan Zhang, Feng-Tian Hen, Rong-Fen Li, Ji-Qin Lian, Zhao-Hui Yang, Hui-Guang Gao
Yan Zhang, Feng-Tian Hen, Rong-Fen Li, Ji-Qin Lian, Zhao-Hui Yang, Hui-Guang Gao, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Correspondence to: Dr. Feng-Tian Hen, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. tmmubiozy@yahoo.com.cn
Received: March 5, 2004
Revised: March 13, 2004
Accepted: March 18, 2004
Published online: June 15, 2004

AIM: To clone human HMGB1 A box and B box cDNA, to construct their prokaryotic expression vectors and to express their products for examining their activity.

METHODS: The total RNA was extracted from human tonsil and the human HMGB1 A box and B box cDNA sequence were amplified using RT-PCR, and inserted into pUC19 for sequence analysis. Then the identified cDNAs were inserted into the new type of prokaryotic expression vector pQE-80 L/DHFR. Having induced by IPTG for 4 h, we confirmed the confusion protein by SDS-PAGE, then identified the expressed confusion protein by Western blotting.

RESULTS: The target DNA fragments by RT-PCR were completely same as the sequence reported in GenBank. The recombinant prokaryotic expression vector was constructed and the fusion protein expressed, which was then identified by Western blotting.

CONCLUSION: Cloning of HMGB1 A box and B box cDNA, construction of their prokaryotic expression vectors and expression of fusion protein have provided the fundamental proof for examining their biological activity.

Key Words: N/A
0 引言

高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-1, HMGB1), 是根据其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有很高的迁移率而得名. 他是一个重要的晚期致炎因子, 与全身性炎症及其并发症毒性综合征(sepsis syndrome)的发生与发展密切相关.巨噬/单核细胞、垂体细胞受内毒素、IL-1a、TNF 刺激后均能释放HMGB1, HMGB1也可刺激巨噬/单核细胞释放致炎因子, 如TNF, IL-1a , IL-1b等[1]. 因此, HMGB1成为抗炎治疗新靶点[2-4]. 目前发现HMGB1还与肿瘤的生长和侵袭(如乳腺癌, 胃肠道肿瘤等)[5-6]以及类风湿关节炎有关[7]. 经结构功能分析HMGB1的致炎活性位于B box, 而另一个结合DNA 的功能结构域HMGB1 A box却能竞争性抑制HMGB1的活性, 但其作用机制尚不清楚. 因此, 我们以人新鲜扁桃体组织总RNA为材料, 经RT-PCR扩增出人 HMGB1 A box和B box 的cDNA 序列, 并将其克隆于载体pUC19进行测序, 随后构建于高效原核表达载体pQE-80L/DHFR, 进一步诱导该蛋白的表达, 从而为今后的深入研究其生物学功能及作用机制打下基础.

1 材料和方法
1.1 材料

人新鲜扁桃体组织取自临床手术切除的扁桃体; 质粒pUC19购自华美公司; 原核表达载体pQE-80L/DHFR由本室保存; 大肠杆菌JM109、DH5a由本室保存; Tripure RNA提取试剂为Roche公司产品; PCR引物由上海生工公司合成; RT-PCR及PCR纯化试剂盒为 Promega公司产品; 限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Promega公司; 小鼠抗人His抗体购自德国Qiagen公司; HRP标记的山羊抗小鼠IgG购自华美公司; 浓缩DAB显色液购自北京中同生物技术有限公司; 硝酸纤维素膜为Roche公司产品.

1.2 方法

取人新鲜扁桃体组织, 按Tripure试剂盒说明提取细胞总RNA, 经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性, 经紫外分光光度计测定其浓度. RT-PCR扩增人HMGB1 A box 和B box cDNA. 根据GenBank中编码人HMGB1 A box (1-85 aa), HMGB1 B box (88-162 aa)的cDNA序列, 分别设计一对特异性引物. HMGB1 A box上游引物: 5'- GC GGT ACC ATG GGC AAA GGA GAT CCT A-3'(划线部分为KpnⅠ 酶切位点), 下游引物: 5'- GC AAG CTT TCA TGT CTC CCC TTT GGG A-3'(划线部分为HindⅢ 酶切位点); HMGB1 B box上游引物: 5'- CC GGT ACC AAG TTC AAG GAT CCC AAT -3'(划线部分为KpnⅠ 酶切位点); 下游引物: 5'- CC AAG CTT TCA ATA TGC AGC AAT ATC C -3' (划线部分为Hind ℃ 酶切位点). RT-PCR按试剂盒说明进行: RNA 5 mL(约1 mg), 5×反应buffer 10 mL, 上、下游引物各2 mL, dNTP 1mL, 25 mmoL/L MgSO4 2 mL, AMV反转录酶1 mL(5U), Tfl DNA聚合酶1mL(5U), ddH2O 26 mL, 总体积为50 mL; 反应程序为48 ℃ 45 min; 94 ℃预变性2 min; 然后(94 ℃ 30 s; 60 ℃ 1 min; 68 ℃ 2 min)×40个循环; 最后68 ℃ 7 min. 分别取5 mL RT-PCR产物于20 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶扫描仪下观察并记录结果. 将RT-PCR产物及载体pUC19经HindⅢ＋KpnⅠ酶切后, 分别用纯化试剂盒进行回收, 按常规条件于16 ℃连接12 h, 将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞, 经蓝白筛选获得阳性重组子, 提取质粒, 经HindⅢ＋KpnⅠ酶切鉴定获得重组质粒(命名为pUC19/HMGB1 A box, pUC19/HMGB1 B box). 然后由上海生工公司进行序列测定. 行DNA测序后, 以HindⅢ＋KpnⅠ酶切pUC19/HMGB1 A box, pUC19/HMGB1 B box质粒, 回收目的片段并连接于原核表达载体pQE-80L/DHFR.将重组原核表达载体转化至大肠杆菌DH5a, 经质粒提取和酶切鉴定得到重组原核表达载体pQE-80L/DHFR/HMGB1 A box, pQE-80L/DHFR/HMGB1 B box. 挑取含重组原核表达载体的单个菌落接种于LB培养基 (含 50 mg/L 氨苄青霉素), 37 ℃培养过夜后, 按10 g/L接种于新鲜LB培养基, 37 ℃培养至A600 nm约为0.7, 加入IPTG至终浓度为 1 mmoL/L, 诱导 4ｈ后, 离心收菌, 行SDS-PAGE(分离胶120 g/L, 积层胶50 g/L), 再经灰度扫描确定菌体总蛋白中目的蛋白的比例. 以所表达目的蛋白上的His标签肽为标志, 经Western blot行进一步鉴定, 其简要步骤是: 将诱导表达的产物先行SDS-PAGE, 然后以半干法电转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上, 取下NC膜短暂漂洗后用丽春红染膜, 待蛋白marker条带显色后用滤纸将膜轻轻吸干, 用记号笔标记蛋白marker各条带, 继而经漂洗去除用丽春红, 然后依次经50 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h, 与抗-His单抗孵育1 h, 与HRP标记的山羊抗小鼠IgG孵育1 h, 每步完成后均严格洗膜, 最后加DAB避光显色.

2 结果
2.1 RT-PCR扩增HMGB1 A box和B box的 cDNA

扩增产物行电泳后, 可见清晰条带, 片段大小分别约为255 bp和225 bp(图1).

图1
图1 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果. 1: 人HMGB1 A box cDNA; 2: 人HMGB1 B box cDNA.
2.2 阳性重组子的筛选

阳性重组子pUC19/HMGB1 A box, pUC19/HMGB1 B box经酶切后, 分别可见约为255bp和225bp大小的目的片段(图2).

图2
图2 重组质粒的酶切鉴定. 1: pUC19/ HMGB1 A box /HindⅢ＋KpnⅠ; 2: pUC19/ HMGB1 B box /HindⅢ＋KpnⅠ; 3: pUC19/ HindⅢ＋KpnⅠ.
2.3 序列测定

人HMGB1 A box cDNA 序列

ATGGGCAAAG GAGATCCTAA GAAGCCGAGA GGCAAAATGT CATCATATGC

ATTTTTTGTG CAAACTTGTC GGGAGGAGCA TAAGAAGAAG CACCCAGATG

CTTCAGTCAA CTTCTCAGAG TTTTCTAAGA AGTGCTCAGA GAGGTGGAAG

ACCATGTCTG CTAAAGAGAA AGGAAAATTT GAAGATATGG CAAAAGCGGA

CAAGGCCCGT TATGAAAGAG AAATGAAAAC CTATATCCCT CCCAAAGGGG

AGACA

人HMGB1 B box cDNA 序列

AAGTTCAAGG ATCCCAATGC ACCCAAGAGG CCTCCTTCGG CCTTCTTCCT

CTTCTGCTCT GAGTATCGCC CAAAAATCAA AGGAGAACAT CCTGGCCTGT

CCATTGGTGA TGTTGCGAAG AAACTGGGAG AGATGTGGAA TAACACTGCT

GCAGATGACA AGCAGCCTTA TGAAAAGAAG GCTGCGAAGC TGAAGGAAAA

ATACGAAAA G GATATTGCTG CATAT

2.4 重组原核表达载体的构建

将序列正确的HMGB1 A box, B box cDNA分别克隆于原核表达载体pQE-80L/DHFR得到重组原核表达载体pQE-80L/DHFR/HMGB1A box, pQE-80L/DHFR/HMGB1B box, 经酶切后分别见约为255 bp和225 bp大小的目的片段(图3).

图3
图3 重组原核表达载体的酶切鉴定. 1: pQE-80L/DHFR / HMGB1 A box /HindⅢ＋KpnⅠ; 2: pQE-80L/DHFR / HMGB1 B box /HindⅢ＋KpnⅠ; 3: pQE-80L/DHFR / HindⅢ＋KpnⅠ.
2.5 重组蛋白的表达与鉴定

重组原核表达载体转化至大肠杆菌DH5a后, 以IPTG诱导表达, 对细胞裂解液进行SDS-PAGE, 结果显示重组目的蛋白在Mr35 000, Mr34 000处分别有一清晰条带, 与预期结果一致, 而含融合蛋白DHFR的空载体 pQE-80L/DHFR的菌株在Mr 26 000处有一清晰条带(图4). 灰度扫描显示目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%, 这表明目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达. 以His标签肽为标志的Western blot分析显示, 经IPTG诱导的含重组原核表达载体pQE-80L/DHFR/HMGB1A box, pQE-80L/DHFR/HMGB1 B box的菌体裂解物能与抗-His单抗特异性反应, 在约Mr 35 000 与Mr 34 000处呈现一条带, 而经同样诱导的含融合蛋白DHFR的空载体 pQE-80L/DHFR在约Mr 26 000有一清晰条带, 说明所表达的融合蛋白的确是目的蛋白(图5).

图4
图4 重组蛋白表达的SDS-PAGE分析. 1: 对照质粒pQE-80L/DHFR未经IPTG诱导; 2: 对照质粒pQE-80L/DHFR经IPTG诱导后; 3:重组质粒pQE-80L/DHFR/HMGB1 A box未经IPTG诱导; 4: 重组质粒pQE-80L/DHFR/HMGB1 A box经IPTG诱导后; 5: 重组质粒pQE-80 L/DHFR/HMGB1 B box未经IPTG诱导; 6: 重组质粒pQE-80 L/DHFR/HMGB1 B box经IPTG诱导后.
图5
图5 重组蛋白的Western blot鉴定. 1: 重组质粒pQE-80L/DHFR/HMGB1 A box经IPTG诱导后; 2: 重组质粒pQE-80L/DHFR/HMGB1 B box经IPTG诱导后; 3: 对照质粒pQE-80L/DHFR经IPTG诱导后.
3 讨论

HMGB1是高迁移率族蛋白超家族的成员, 根据结构特点高迁移率族蛋白超家族可分为HMGB、HMGN、HMGA三类家族, 而HMGB1属于HMGB家族, 真核细胞染色质中含有丰富的HMGB1, 人HMGB1含215个氨基酸残基, 基因定位于染色体13q12. N 端富含赖氨酸, 而氨基酸序列高度保守的C 端(又称产酸尾端, "acidic tail", 富含天冬氨酸和谷氨酸. HMGB1含有2 个约80aa组成的"L"型的HMG box, 分别是A box(1-85 aa) 和B box (88-162 aa) 是结合DNA的功能结构域.其中B box 是HMGB1发挥致炎功能的主要区域[8], 而A box却能竞争性抑制HMGB1的致炎功能. 膜相关的HMGB1结合的受体是RAGE (receptor for advanced glycation end products). 内皮细胞、血管平滑肌细胞、神经元、单核/巨噬细胞均表达RAGE[9]. HMGB1与RAGE高亲和力结合, 较其他的RAGE配体高7倍. HMGB1与RAGE结合能诱导大鼠平滑肌细胞的迁移[10]和促进轴突生长[11], 而且能抑制肿瘤的生长和转移[12]. 目前的研究发现细胞表面可能还存在着其他的HMGB1受体[13]. 目前, 发现HMGB1可作为晚期致炎因子, 密切参与炎症的发生发展. 动物实验表明, 大鼠经致死量脂多糖 (LPS)处理后, TNF、IL-1b等早期致炎因子一般都在6 h内达到高峰, 然后很快回到基础水平, 而大鼠仍在攻击后数日内死亡, 故提示内毒素血症致死亡的过程中, 存在一种迟发递质即HMGB1起着重要的作用. TNF基因敲除小鼠在注射高剂量的内毒素后数小时至数天内也发生死亡. 同时, Wang et al用LPS刺激大鼠RAW264.7细胞, 并用SDS-PAGE法分析此条件培养基, 发现LPS刺激后18ｈ即可诱发一种Mr 30 000的蛋白质出现, 而在早期此种蛋白质并不突出, 经氨基酸序列分析证实这种迟发递质为大鼠HMGB1. 巨噬细胞、单核细胞、垂体细胞受内毒素、IL-1、TNF 刺激后在胞内形成丰含HMGB1的囊泡, 再以胞吐的方式释放HMGB1[14], 同时, HMGB1也可刺激单核细胞、巨噬细胞释放致炎因子, 如TNF, IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8, MIP-1a, MIP-1b等. 因此, 我们选用了手术切除的人新鲜扁桃体组织来提取总RNA, 最终获得了与已知序列完全一致的目的片段. 由于HMGB1A box、 HMGB1 B box的分子量分别只有10 000和9 000, 难以在细菌体内形成正确的折叠和稳定表达, 容易被降解, 因此我们从pQE-40L质粒上截取了表达二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因片段, 与目的基因片断一起连接于表达载体pQE-80L上, 从而获得了HMGB1A box, HMGB1 B box融合蛋白稳定的表达.另外, 我们所采用的原核表达载pQE-80L是一种高效表达载体, 该载体表达的目的蛋白量可达到细胞蛋白总量的50%, 表达蛋白的N端带有6×His-tag, 便于纯化和检测.

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