病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 813-816
在线出版日期: 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.813
丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究
洪源, 杨倩, 成军, 刘妍, 王建军
洪源, 杨倩, 成军, 刘妍, 王建军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
洪源, 男, 1974-12, 福建省莆田市人, 汉族. 1998年毕业于第四军医大学军医系, 获医学学士学位, 2003年毕业于解放军军医进修学院, 获得内科传染病学硕士学位, 主要课题方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15

目的: 探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对NS3TP6启动子转录的激活作用.

方法: 以我实验室前期研究中得到的HCV NS5A/NS3的基因表达谱芯片结果为基础, 利用生物信息学技术确定NS3TP6的启动子区域(NS3TP6-p), 聚合酶链反应(PCR)扩增NS3TP6-p, 克隆至真核报告载体pCAT3中, 构建pCAT3-NS3TP6-p报告载体; 以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系, 用酶联免疫黏附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性; 并与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系, 用ELISA法检测CAT的表达活性.

结果: 限制性内切酶消化和序列分析结果表明, 构建的NS3TP6-p指导的报告基因表达载体pCAT3-NS3TP6-p正确无误. pCAT3-NS3TP6-p在HepG2细胞中能够启动CAT的表达; 共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A组CAT的表达活性是pCAT3-NS3TP6-p单独转染试验的1.87 倍.

结论: 我室克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性; HCV的NS5A蛋白具有对NS3TP6基因启动子的转录具有反式激活作用. 本实验进一步验证了我室利用基因表达谱技术研究HCV NS5A蛋白反式激活作用的结果, 为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

关键词: N/A
引文著录: 洪源, 杨倩, 成军, 刘妍, 王建军. 丙型肝炎病毒NS5A蛋白上调NS3TP6基因启动子表达活性的研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(4): 813-816
Up-regulating effect of hepatitis C virus NS5A protein on NS3TP6 gene promoter
Yuan Hong, Qian Yang, Jun Cheng, Yan Liu, Jian-Jun Wang
Yuan Hong, Qian Yang, Jun Cheng, Yan Liu, Jian-Jun Wang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, the 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: Grants from the National Natural Scientific Foundation, No. C03011402, No. C30070689; and the 9.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 98D063; and the Launching Foundation for Student Studying Abroad of PLA, No. 98H038; and the 10.5 Youth Research and Technique Foundation of PLA, No. 01Q138; and the 10.5 Research and Technique Foundation of PLA, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: November 13, 2003
Revised: December 1, 2003
Accepted: December 16, 2003
Published online: April 15, 2004

AIM: To investigate the regulatory effects of non-structural protein 5A of hepatitis C virus (HCV NS) protein on NS3TP6 gene promoter.

METHODS: The sequence of NS3TP6 gene promoter was identified in GenBank by bioinformatics and amplified from HepG2 genome by polymerase chain reaction (PCR), which was cloned into pCAT3 reporter vector. The HepG2 cell line was transfected by pCAT3-NS3TP6-p, and co-tranfected by pCAT3-NS3TP6-p and pcDNA3.1(-)-NS5A, respectively. The chloramphenicol acetyltransferase (CAT) activity was detected by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

RESULTS: The recombinant vector of reporter gene expressive vector pCAT3-NS3TP6-p was approved correctly by restriction enzyme digestion and sequencing analysis. In the transfection experiment of HepG2, pCAT3-NS3TP6-p had higher activity of CAT expression than that of pCAT3-basic demonstrated by an ELISA kit. The expression level of CAT in co-transfection of pCAT3-NS3TP6-p and pcDNA3.1(-)-NS5A was 1.87 times as higher as that of pCAT3- NS3TP6-p plasmid alone.

CONCLUSION: Cell transfection and ELISA technology are successfully used to prove the results from microarray of HCV NS5A, which brings some new clues for studying the trans-regulated and immune regulation mechanism of NS5A.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属, 是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒. 在大多数感染人群中HCV表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌(HCC), 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关[1-10]. HCV基因组含有单一的开放读码框架, 编码3 010-3 033个氨基酸残基(aa)的多肽前体, 两侧是5'-非翻译区及3'-非翻译区. 因为HCV的基因复制形式没有经过DNA阶段, 不存在HCV基因组与肝细胞基因组DNA的整合, 所以, HCV主要是通过基因组编码蛋白和肝细胞蛋白之间的相互作用及肝细胞蛋白与HCV调节基因的相互作用造成对肝细胞的损伤. 其中非结构蛋白NS5A具有多种生物学功能, 在HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程中具有十分重要的作用[11-14]. 研究表明, NS5A上存在干扰素敏感决定区(ISDR), 与干扰素治疗的敏感性相关[15-16]; 此外, NS5A还是一种作用很强转录激活因子[17-21], 调控着细胞基因的转录, 还包括对细胞周期及细胞生长的调节, 并与感染HCV的细胞发生恶性转化过程有关. 对于NS5A蛋白的反式调节功能, 我实验室已证明他可以反式激活SV40早期启动子/增强子[21], 并应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)和基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)[24-26]等不同的技术对NS5A/NS3的反式调节基因进行了研究[22-23]. 为了对NS5A反式调节基因的筛选结果进行验证, 我们选取了基因表达谱芯片得到的NS5A反式调节基因-NS3TP6为研究对象, 利用生物信息学手段对NS3TP6上游调控序列进行分析、克隆, 并与报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)构建表达质粒, 与NS5A表达载体共转染, 研究NS5A对NS3TP6启动子(promoter)是否具有激活作用, 使下游CAT基因的表达增强, 这一结果也为研究NS5A的信号传导途径提供新的理论依据.

1 材料和方法
1.1 材料

大肠杆菌DH5, 肝母细胞瘤细胞系HepG2、pcDNA3.1(-)-NS5A, 为本室保存. pGEM-T、pCAT3载体购自Promega公司, 脂质体FuGENE6购自Roche公司, Taq DNA 聚合酶购自鼎国生物公司, 限制性内切酶购自Takara公司. 质粒DNA提取试剂盒(Promega公司), 玻璃奶DNA回收试剂盒(博大公司), CAT ELISA试剂盒(Roche公司). 引物合成、核苷酸序列测序由上海博亚公司完成.

1.2 方法

1.2.1 启动子结构分析: 根据GenBank中NS3TP6基因组序列, 确定NS3TP6的转录起始点, 选取其上游1 000 bp, 通过在线分析(http://http://www.fruitfly.org)预测其启动子活性区域. 设计并合成引物, 在上下游引物的5'-端分别加上Kpn I和Xho I酶切位点序列. 上游引物: 5'-GGT ACC TTC TTG ACT TTT GGT GTC TTG-3'; 下游引物: 5'-CTC GAG CAG CAT TCA GTC TAC AAC CAG-3'.

1.2.2 质粒构建: PCR扩增NS3TP6启动子序列, 玻璃奶纯化回收DNA片段, 在T4 DNA连接酶的作用下, 与pGEM-T载体连接, 转化大肠杆菌DH5, 挑取在选择平皿(Amp, X-gal/IPTG)生长的白色阳性菌落提取质粒, 经酶切(Kpn I/Xho I)及测序鉴定. Kpn I/Xho I双酶切重组质粒pGEM-T-NS3TP6-p, 玻璃奶纯化回收酶切产物, 定向克隆至pCAT3载体, 构建成重组质粒pCAT3-NS3TP6-p. 经双酶切及菌落PCR鉴定连接产物, 试剂盒法提取质粒以备转染.

1.2.3 细胞培养及pCAT3-NS3TP6-p转染肝母细胞瘤细胞系: HepG2细胞系在含10%小牛血清的DMEM培养液中生长. 细胞生长至50%-80%融合度时采用脂质体转染法, 具体转染方法参照FuGENE6说明书进行, 质粒pCAT3-NS3TP6-p转染48 h后收获细胞.

1.2.4 共转染实验: 细胞生长至50%-80%融合度时, 质粒pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3.1(-)-NS5A共转染HepG2细胞系. 具体转染方法参照FuGENE6说明书进行, 转染48 h后收获细胞.

1.2.5 CAT表达量的检测: 将收获的细胞进行裂解, 提取上清液, 取200 L用于检测CAT的表达量. 具体方法严格按照CAT ELISA试剂盒说明书进行, 在415 nm光波下测吸光度A值.

2 结果
2.1 NS3TP6启动子结构

根据GenBank中基因组序列, 确定NS3TP6的转录起始点, 选取其上游1 080 bp, 其核苷酸序列见图1. 对此序列进行分析发现有多个TATA盒及TATA样盒存在.

图1
图1 NS3TP6基因转录起始点上游序列.
2.2 在线分析(http://http://www.fruitfly.org)预测其启动子活性区域.

Start End Score Promoter Sequence

639 689 0.90 cctctcattgtataaatgtacgggttattatttaatttcagaaacaatca

2.3 重组质粒的构建

以HepG2基因组为模板, PCR扩增NS3TP6启动子序列, 1 000 bp处出现所需条带. 将扩增产物与pGEM-T载体连接, 双酶切鉴定, 并送测序鉴定正确. 双酶切产物与pCAT3载体连接, 双酶切鉴定如图2所示(4 000 bp的pCAT3-basic载体片段和1 081 bp的NS3TP6启动子片段), 连接转化生长的菌落进行PCR鉴定所示, 于1 081 bp处可见理想条带.

图2
图2 以HepG2基因组DNA为模板, PCR 扩增NS3TP6启动子序列.
2.4 重组质粒转染实验及报告基因CAT的检测

将重组质粒pCAT3-NS3TP6-p转染HepG2细胞, 可见pCAT3-NS3TP6-p具有启动子活性, pcDNA3.1(-)-NS5A和pCAT3-NS3TP6-p共转染后, CAT的表达较对照质粒明显升高, 说明NS5A对NS3TP6启动子具有激活作用(表1), 重复试验得到同样的结果(表2).

表1 pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A共转染后CAT的表达.
组别质粒吸光度(A值)
阴性对照pCAT3-basic0.033
阳性对照(control)pCAT3-control2.215
实验组pCAT3-NS3TP6-p0.165
共转染组pCAT3-NS3TP6-p+ pcDNA3.1(-)-NS5A0.329
表2 pCAT3-NS3TP6-p+pcDNA3.1(-)-NS5A共转染重复实验.
组别质粒吸光度(A值)
阴性对照pCAT3-basic0.045
阳性对照(control)pCAT3-control0.879
实验组pCAT3-NS3TP6-p0.182
共转染组pCAT3-NS3TP6-p+ pcDNA3.1(-)-NS5A0.317
3 讨论

HCV非结构蛋白NS5A为丝氨酸磷酸化蛋白, 因磷酸化程度的不同而存在p56和p58两种胞质磷酸化蛋白形式. NS5A定位于肝细胞内质网核周区网状膜, 形成核糖核蛋白复合物, 在病毒基因组的翻译中起重要的作用. 同时NS5A因为能直接与双链RNA依赖的蛋白激酶结合, 并使其失活, 从而抵抗IFN的抗病毒而受到广泛的重视[27-30]. 目前研究认为NS5A除上述的作用外, 还具有转录反式激活因子的功能, 但其确切的机制及途径并不十分清楚. 研究发现NS5A可以引起胞内Ca2+分布异常, 启动Ca2+相关的信号传导途径, 导致转录因子蛋白NF-B 和STAT-3转位于核内, 发挥其反式激活作用[31-36].

尽管NS5A蛋白是存在于胞质中, 但研究发现其具有功能性核定位信号(nucleic localization signal, NLS)序列, 即PPRKKRVV(354-362 aa), 因此有核信号转导功能[37]. Satoh et al[38]为了说明NS5A蛋白的细胞定位, 他们采用多种NS5A蛋白N-端或C-端缺失突变体, 通过在细胞株中短暂表达的亚细胞定位分析发现, N-端缺失的NS5A蛋白位于细胞核, 并且只要NS5A蛋白N-端27个氨基酸残基序列缺失, 就可使其定位于胞核中, 因此他们认为NS5A蛋白的细胞定位主要决定于其N-端的分子结构. 同时, 他们也研究了NS5A蛋白的分解过程, 认为NS5A蛋白裂解仅发生在其N-端和C-端的少数几个位点, 此裂解作用可以被凋亡刺激剂加强, 被半胱氨酸蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK所抑制, 说明NS5A蛋白的裂解来源于一种或几种半胱氨酸蛋白酶样的蛋白酶. 基于对NS5A蛋白突变的分析, 他们推测裂解产物包括一种去除N-端和C-端的NS5A蛋白(155-389 aa), 与此种裂解产物相同氨基酸序列的多肽存在于细胞核中. 我们利用基因芯片技术对于HCV的NS5A反式调节的靶基因成功地进行了筛选, 其中上调NS3TP6基因表达的能力最强-Cy5/Cy3值达3.4. NS3TP6基因为邵清 et al[39] 于2 003年从人肝组织cDNA文库中测序得来, 目前对于他的功能研究并不多. 通过美国国立图书馆(NCBI)在线软件分析, 确定NS3TP6基因的启动子序列, 构建CAT表达的载体, 与NS5A表达载体共转染, 结果表明NS5A可以激活NS3TP6基因的启动子, 与对照组相比A值升高约2倍, 重复试验亦得到同样的结果. 结合基因芯片结果, 我们认为NS5A上调NS3TP6基因的表达, 可能与NS5A对基因启动子的激活有关, 这一结论还需要NS5A胞质信号传导通路阻断试验进一步证实. 总之, 本研究验证了前期NS5A反式激活基因的筛选结果, 为丙肝病毒的反式调节机制提供了新的线索.

编辑: N/A

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