修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
目的: 筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因, 阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.
方法: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因. 以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 同时进行表达谱基因芯片技术分析.
结果: 成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库, 对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析. 在SSH分析中, 文库扩增后均得到200-800 bp插入片段. 对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列. 对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型, 以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析, 发现了一系列的共同调节的靶基因, 说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.
结论: 筛选到的反式调节靶基因, 包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了HBV和HCV蛋白可能存在的调控机制, 有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
引文著录: 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 杨倩, 王琳. 乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 327-331
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004
AIM: To clone and identify human genes transactivated by hepatitis B and C viral proteins via construction of a cDNA subtractive library with suppression subtractive hybridization (SSH) technique and cDNA microarray techniques.
METHODS: Suppression subtractive hybridization (SSH) and cDNA microarray techniques were used for screening and cloning of the target genes transactivated by hepatitis B and C viral proteins. The mRNA was isolated from HepG2 cells transfected recombinant vector expressing hepatitis B and C viral proteins and pcDNA3.1(-) empty vector,respectively. SSH and cDNA microarray were employed to analyze the differentially expressed DNA sequence between the two groups. In SSH assay, after restriction enzyme Rsa I digestion, small sizes of cDNAs were obtained. Then tester cDNA was divided into two groups and ligated to the specific adaptor 1 and adaptor 2, respectively. After tester cDNA was hybridized with driver cDNA twice and underwent two times of nested PCR and then was subcloned into T/A plasmid vectors to set up the subtractive library. Amplification of the library was carried out with E. coli strain JM109. The cDNA was sequenced and analyzed in GenBank with Blast search after PCR.
RESULTS: The subtractive library of genes transactivated by hepatitis B and C viral proteins was constructed successfully. The up-regulated and down-regulated genes from cDNA microarray assay was conducted for each of the hepatitis B and C viral proteins. The results were compared.
CONCLUSION: The obtained sequences may be target genes transactivated by hepatitis B and C viral proteins, among which some genes coding proteins involve cell cycle regulation, signal transduction, tumor immunity and development, and apoptosis.
- Citation: Cheng J, Liu Y, Hong Y, Wang JJ, Yang Q, Wang L. Comparisons of differentially expressed genes transactivated by hepatitis B and C viral proteins using suppression subtractive hybridization and cDNA micro-array techniques. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(2): 327-331
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i2/327.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i2.327
引起慢性病毒性肝炎和终末性肝病(ESLD)的肝炎病毒主要包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)[1]. 肝炎病毒感染肝细胞之后, 在肝细胞中完成复制和表达的生活周期, 翻译而成的肝炎病毒蛋白除了完成病毒颗粒自身的装配之外, 在肝细胞中会产生一系列的生物学效应[2]. 一方面作为机体免疫系统识别的靶抗原, 使得肝炎病毒感染的靶细胞转变成为机体免疫系统识别和攻击的对象, 这是慢性病毒性肝炎发病的基本过程和基本机制[3]. 其次, 肝细胞中的肝炎病毒蛋白, 不是孤立存在的, 或者是与其自身结合, 形成同二聚体结构, 或者与肝细胞中的蛋白结合形成异二聚体, 甚至是多聚体形式, 改变肝细胞中蛋白激酶的活性或者酶活性底物的性质[4]. 第三, 有些肝炎病毒蛋白, 在翻译之后, 可以发生细胞内转位, 在肝细胞核中分布的肝炎病毒蛋白不少具有直接的DNA结合活性, 对于肝细胞的基因启动子序列产生直接的影响, 或者在肝细胞核中, 与转录因子蛋白结合, 间接影响肝细胞的基因转录过程[5]. 肝炎病毒蛋白通过蛋白与蛋白之间的结合, 通过对肝细胞基因组表达谱的调节, 影响肝细胞本身正常的代谢和信号转导途径, 进而影响肝细胞的细胞周期、细胞凋亡、细胞的恶性转化等过程[6].
无论是直接还是间接形式, 肝炎病毒蛋白对于肝细胞基因表达谱的影响是肝炎病毒感染导致各种肝脏病变的基本机制, 因此, 对于肝炎病毒蛋白的反式调节作用的机制研究显得非常重要[7]. 近年来差异显示技术的出现和发展, 大大促进了慢性病毒性肝炎及其相关疾病机制的研究进展, 从目前的研究结果来看, DNA芯片(DNA chip)、抑制性消减杂交(SSH, suppression subtractive hybridization)是研究肝炎病毒蛋白反式调节作用靶基因的有效技术类型[8-10]. 我们选择了HBV基因组编码的截短型表面抗原中蛋白(MHBst)[11]、X蛋白(HBxAg)[12], HCV基因组编码的核心蛋白(core)[13]、非结构蛋白3(NS3)[14]、非结构蛋白5A(NS5A)[15]等5种肝炎病毒的反式调节蛋白, 利用基因芯片和SSH技术同时进行研究, 对肝炎病毒蛋白反式调节作用的靶基因, 以及研究肝炎病毒蛋白反式调节作用的分子生物学技术进行了比较研究.
表达MHBst的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst[16]、表达X蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBxAg[17]、表达HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-core[18]、表达HCV非结构蛋白3的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS3[19]、表达HCV非结构蛋白5A的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A[20], 由本基因治疗研究中心构建.
人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol均购自Gibco公司, 真核表达质粒由本室构建. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂FuGENE将2 μg载体质粒转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存.
使用Trizol试剂一步法提取表达质粒和空载体转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化.
参照Schena et al方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+0.2% SDS杂交液中.
芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 μg /μL溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2% 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h.
将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+ 0.2% SDS、0.1%×SSC +0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.
用FuGENE6 转染试剂将表达载体及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2 细胞, 48 h后收获细胞. 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析. 用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit中的试剂, 以获得的mRNA为模板逆转录合成cDNA.
采用Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit, 常规SSH方法按说明书进行: 转染了核心表达质粒及空载体的HepG2 细胞cDNA分别标记为Tester和Driver, 经RsaⅠ(一种识别4碱基序列的内切酶)消化, 产生相对较短的平端片段, 纯化酶切产物. 将Tester的cDNA分为两份, 分别连接试剂盒提供的特殊设计的寡核苷酸接头Adapter 1和Adapter 2, 然后与过量的Driver cDNA进行杂交; 合并两种杂交产物后再与Driver cDNA作第2次杂交; 然后将杂交产物做选择性PCR扩增, 使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增.
扩增产物与pGEM-Teasy载体连接, 转化JM109感受态细菌, 在含氨苄青霉素的LB/X-gal/IPTG培养板上, 37 ℃培养18 h. 挑取白色菌落, 增菌, 以pGEM-Teasy载体多克隆位点两端T7/SP6引物进行菌落PCR扩增, 证明含有插入片段后(100-1 000 bp), 测序(上海申友公司). 应用生物信息学将测得序列GenBank数据库进行同源性分析.
应用SSH技术对于5种肝炎病毒蛋白的反式调节基因进行筛选, 分别获得了一系列的反式调节靶基因. 对于各种肝炎病毒蛋白反式调节基因进行对比分析, 发现6种基因至少受到3种肝炎病毒蛋白的反式调节. 包括核糖体蛋白(RP)、NADH脱氢酶、真核翻译延伸因子、纤维连接蛋白(Fn)、磷脂酶A2(PPA2)、真核翻译启动因子等(表1).
| RP | NADH脱氢酶 | 真核翻译延伸因子 | Fn | PPA2 | 真核翻译启动因子 | |
| MHBst | + | + | + | + | + | + |
| X | + | + | + | |||
| Core | + | + | + | + | + | |
| NS3 | + | + | + | |||
| NS5A | + | + | + | + |
在基因芯片研究中, 发现RET、FAP48、MDM4、PRKAR2B、KCNJ3等基因类型至少受到2种肝炎病毒的反式调节(表2).
| RET | FAP48 | MDM4 | PRKAR2B | KCNJ3 | |
| MHBst | + | + | + | ||
| X | + | + | + | + | + |
| Core | + | + | + | + | |
| NS3 | + | + | |||
| NS5A | + | + |
对于5种肝炎病毒反式调节作用蛋白的SSH和表达谱基因芯片技术分析结果进行比较研究, 发现一些共同的反式调节靶基因. 2种技术同时发现的反式调节基因类型包括: MHBst调节原癌基因c-myc、HBxAg蛋白反式调节S-100钙结合蛋白A11、HCV核心蛋白反式调节、HCV NS3蛋白反式调节真核翻译延伸因子2(EEF2)、HCV NS5A蛋白反式调节新基因序列KIAA1641等.
关于SSH和基因芯片分析技术的价值的评价, 认为目前这2种技术都是研究反式调节作用的重要技术类型, 至少在相当长的一段时间内, 2种技术都有重要的应用前景, 不可相互替代. SSH技术由于对于筛选的对象没有先决条件, 因此可以筛选到一些未知基因. 但是由于SSH技术的局限性, 一次SSH技术分析不可能将所有的反式调节基因一网打尽. 因此, SSH结果具有相当的或然性. 表达谱基因芯片研究虽然可以进行高通量筛选, 但是却受到芯片容量的限制. 对于人类基因组编码基因数量估计目前仍然有争议, 但是不管是3-6万个还是10万个, 我们应用的1 152点的基因芯片的容量仍然是全部基因的一小部分. 这样的基因芯片分析结果会漏掉大部分的基因. 虽然SSH和基因芯片技术的特点和明显的局限性, 但是这2种技术在肝炎病毒蛋白反式调节作用研究中仍然具有十分重要的应用前景[31-34]. Miyasaka et al[35]采用SSH技术, 对于HCC和非HCC组织中基因表达差异进行了筛选. 从中鉴定出7种已知功能基因: 局灶黏附激酶、结肠癌缺失基因、鸟嘌呤结合抑制蛋白α、谷酰胺合成酶、鸟氨酸氨基转移酶、M130和胃蛋白酶原 C, 以及2种 在HCC组织中过表达的新基因. 只有一种基因(decorin)在 HCC中的表达水平下调. 建立了定量RT-PCR对于这些基因的表达水平进行检测, 证实了这些基因在实验组HCC组织和其他HCC组织中高表达. Patzwahl et al[36]对于HCV感染肝组织的基因表达谱变化进行了研究. 发现一些基因的表达水平有显著改变: IFNα诱导的趋化因子IP-10、IFNα/β诱导的MxA基因、IFNα/β诱导的p44、IFNα/β/γ诱导的IFI-56K基因等. 因此, 我们和其他的研究者的结果都表明, 在肝炎病毒以及病毒性肝炎研究中, SSH和表达谱基因芯片技术都是重要的技术类型[37-44].
关于肝炎病毒调节共同机制问题的研究十分重要. HBV和HCV分属于DNA和RNA病毒, 引起肝脏疾病的分子生物学机制不尽相同, 但是, 引起的慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的特点却十分相似, 因此我们不能不重视不同肝炎病毒引起肝脏疾病的共同的机制途径. 在本项研究中, 我们不仅发现了不同的肝炎病毒蛋白反式调节相同的靶基因, 而且利用不同的差异显示技术, 同时证实了对于相同基因的反式调节作用. 研究的5种肝炎病毒反式调节作用蛋白都对于核糖体蛋白(RP)的基因具有反式调节作用, 或者一种基因受到大多数肝炎病毒蛋白的反式调节, 另外也发现在SSH和基因芯片研究中都能发现MHBst调节原癌基因c-myc、HBxAg蛋白反式调节S-100钙结合蛋白A11、HCV NS3蛋白反式调节真核翻译延伸因子2(EEF2)、HCV NS5A蛋白反式调节新基因序列KIAA1641等. 因此, 从这些反式调节作用的共同特点方面, 也可以推测肝炎病毒蛋白反式调节作用的基本情况和机制.
SSH和基因芯片技术分析也是发现肝炎病毒蛋白调节新基因的重要研究思路. 基因芯片研究的结果, 受到基因芯片容量及选择对象的限制, 但是如果将一些推测的未知功能基因做成基因芯片, 就可以发现新的基因. SSH技术分析的结果因为是随机的, 对于所克隆的基因对象没有先决条件, 而且近年来SSH技术的改进, 通过对于低丰度基因的扩增, 不仅可以克隆到丰度较高的基因, 也可以克隆到丰度较低的基因[45-55]. 由于SSH基因的操作的随意性和效率方面的限制, 不可能一次实验操作把所有的基因都筛选到, 但是可以筛选到任何表达类型的基因. 所以, 这2种技术对于发现新的反式调节的新基因类型都是适用的. 我们在本项研究中克隆了一系列的肝炎病毒反式作用的靶基因, 说明了SSH和基因芯片技术在克隆反式调节作用新基因研究中的重要应用前景. 但是必须指出, 无论是SSH还是基因芯片技术, 除了存在前面讨论的假阴性之外, 都存在一定比例的假阳性, 因此还必须结合其他类型的分析技术进行甄别. 我们利用启动子指导的报告基因的表达载体的构建以及真核细胞共转染技术的分析, 证实了大部分的SSH和基因芯片的分析结果都是比较可靠的. 这一点特别令人鼓舞. 相信SSH和基因表达谱芯片技术, 随着技术本身的不断改进, 将会在肝炎病毒蛋白的反式调节作用的研究中发挥更大的作用.
编辑: N/A
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