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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 杨倩, 王琳, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
成军, 男, 1963-08-17生, 山东省淄博市人, 汉族. 1986年毕业于第一军医大学军医系, 获医学学士学位, 1989年毕业于军医进修学院, 获传染病学硕士学位, 1994年毕业于北京医科大学, 获传染病学博士学位, 1994-11-17/1997-12-01在美国得克萨斯大学健康科学中心临床免疫与传染病科完成博士后研究, 主任医师. 回国后从事传染病特别是病毒性肝炎的临床工作和基础研究, 主要学术研究方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15
Abstract
目的: 筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因, 阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.
方法: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因. 以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 同时进行表达谱基因芯片技术分析.
结果: 成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库, 对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析. 在SSH分析中, 文库扩增后均得到200-800 bp插入片段. 对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列. 对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型, 以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析, 发现了一系列的共同调节的靶基因, 说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.
结论: 筛选到的反式调节靶基因, 包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了HBV和HCV蛋白可能存在的调控机制, 有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
Keywords: N/A