病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-02-15; 12(2): 323-326
在线出版日期: 2004-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i2.323
应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究
李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 王建军, 张健, 刘妍, 程明亮
李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 王建军, 张健, 刘妍, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
程明亮, 贵阳医学院传染科 贵州省贵阳市 550004
李强, 男, 1969-09-10, 四川省泸州市人, 汉族, 1992年重庆医科大学本科毕业. 贵阳医学院2001级内科传染病学专业硕士研究生, 主要从事病毒性肝炎研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-07-12
修回日期: 2003-08-10
接受日期: 2003-08-16
在线出版日期: 2004-02-15

目的: 应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9)的反式调节基因.

方法: 构建NS5ATP9基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9, 应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5ATP9转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体pcDNA3.1(-)的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: HepG2细胞经转染NS5ATP9后, 有16条差异基因表达水平发生显著改变, 其中3条基因表达增强, 13条基因表达降低. 这些差异表达的基因与细胞的增生、分化、凋亡及细胞的信号转导密切相关.

结论: 应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒NS5ATP9作用HepG2细胞后差异表达基因, 为阐明NS5ATP9的作用提供了新的依据.

关键词: N/A
引文著录: 李强, 梁耀东, 成军, 王琳, 王建军, 张健, 刘妍, 程明亮. 应用表达谱芯片技术筛选NS5ATP9反式调节基因的研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(2): 323-326
Screening of genes trans-regulated by NS5ATP9 with cDNA microarray assay
Qiang Li, Yao-Dong Liang, Jun Cheng, Lin Wang, Jian-Jun Wang, Jian Zhang, Yan Liu, Ming-Liang Cheng
Qiang Li, Yao-Dong Liang, Jun Cheng, Lin Wang, Jian-Jun Wang, Jian Zhang, Yan Liu, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Yan Liu, Department of Infections Diseases, Guiyang Medical University First Hospital, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: July 12, 2003
Revised: August 10, 2003
Accepted: August 16, 2003
Published online: February 15, 2004

AIM: To screen the genes trans-regulated by NS5ATP9 with cDNA microarray assay.

METHODS: The recombined expressive plasmid pcDNA 3.1(-)-NS5ATP9 was constructed, and HepG2 cells were transfected. Total mRNA was isolated from the HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1(-)-NS5ATP9, respectively. cDNA microarray was employed for detecting and analyzing of mRNA from both HepG2 cells transfected.

RESULTS: From the microarray assay, 3 genes were found up-regulated, and 13 genes down-regulated. Their encoding proteins were involved in cell signal transduction, cell proliferation, cell apoptosis and differentiation.

CONCLUSION: cDNA microarray technology is successfully used to screen diversity genes expressed by NS5ATP9 in HepG2 cells, which brings some new clues for the study of the function of NS5ATP9.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是正链RNA病毒, 是慢性肝炎、肝纤维化、肝癌的病因, 而且与肝脏脂肪变、糖代谢紊乱有关. 全世界慢性感染的人数超过1.7亿[1]. 而病毒基因组编码的蛋白与宿主肝细胞蛋白之间的相互作用, 可能是HCV致病的重要分子机制. HCV非结构蛋白5A(HCV NS5A)基因编码蛋白除了参与HCV多蛋白的成熟和RNA的复制过程外, 还具有多种生物学功能. 不同磷酸化形式的NS5A蛋白具有反式激活作用, 这引起许多学者研究NS5A生物学功能的兴趣.

我们实验室应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术, 筛选出HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9, 在GenBank中注册, 注册号为AF529370. NS5ATP9基因的编码序列全长为336个核苷酸(nt), 编码产物由111个氨基酸残基(aa)组成. 为了进一步研究NS5ATP9的作用, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)[2-3] 对于NS5ATP9的反式调节基因进行了筛选, 以便对这种基因的功能进行初步研究.

1 材料和方法
1.1 细胞培养及取材

人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂及总RNA提取试剂Trizol均购自Gibco公司, NS5ATP9真核表达质粒由本室构建. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂FuGENE将2 μg pcDNA3.1(-)-NS5ATP9和空载体pcDNA3.1(-) 转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存.

1.2 总RNA提取

使用Trizol试剂一步法提取NS5ATP9表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP9和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28S、18S条带变化.

1.3 探针标记

参照Schena et al[4]方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+0.2% SDS杂交液中.

1.4 芯片制备

芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因、抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 μg/μL溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2% 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.5 预杂交

将预杂交液放入95 ℃水浴锅内变性2 min, 将待预杂交的芯片放入95 ℃水浴锅内变性30 s, 芯片取出后即放入无水乙醇中30 s, 晾干. 将已变性的预杂交液加到芯片的点样区域内, 盖上盖玻片, 放入杂交箱内42 ℃预杂交5-6 h.

1.6 杂交及洗涤

将探针置于95 ℃水浴中变性2 min; 芯片置于95 ℃水浴中变性30 s, 芯片取出浸无水乙醇30 s, 探针取出后迅速置于冰上. 将探针置于芯片上, 用盖玻片覆盖, 置于杂交舱中, 用Parafilm密封, 放入42 ℃杂交箱内杂交过夜(16-18 h). 依次以2×SSC+ 0.2% SDS、0.1%×SSC +0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.7 扫描与分析

用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果
2.1 总RNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A280>1.92, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h的电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA.

2.2 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交体系, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共16条, 占1.4%, 其中3条基因表达增强, 13条基因表达降低.

2.3 差异表达基因分析

表达增强的基因有3条, 见表1. 表达降低的基因有13条, 见表2.

表1 表达显著增加的基因.
编号编码蛋白Cy5/Cy3
1NY肾癌抗原-62(NY-REN-62)2.023
2脆性X综合征1(FMR1)2.144
3硫氧还蛋白还原酶(TXNRD1)2.174
表2 表达显著降低的基因.
编号编码蛋白Cy5/Cy3
1核因子κB轻链多肽增强子1(NFKB1)0.250
2亲代谢性谷氨酸盐受体7型GRM70.327
3TU3A蛋白(TU3A)0.331
4核糖核苷酸还原酶M2多肽(RRM2)0.345
5未知KIAA0668蛋白0.349
6未知FLJ219850.371
7细胞分化相关ATP结合蛋白(APACD)0.377
8甲状旁腺激素应答骨肉瘤B1蛋白(B1)0.400
9金属蛋白酶的组织抑制因子1(TIMP1)0.419
10谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)0.422
11细胞色素P450亚目2多肽6(CYP2D6)0.427
12GGI99蛋白(LOC51637)0.473
134-氨基丁酸氨基转移酶(ABAT)0.493
3 讨论

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9是NS5A的反式激活新型靶基因编码的蛋白, 研究他的功能对理解NS5A蛋白的作用具有重要意义. 丙型肝炎病毒编码的NS5A蛋白对HCV感染与肝纤维化及肝细胞癌的发生密切相关. HCV NS5A位于HCV多蛋白的羧基末端, 是丝氨酸磷酸化蛋白质, 依磷酸化程度的不同而产生两种不同分子量大小的多肽p56和p58. Kato et al[5-6]研究发现, NS5A是转录反式激活因子, 其羧基末端富含酸性氨基酸及脯氨酸, 这是真核细胞转录因子特有的结构特征, 但是其参与细胞转录调节的机制仍不十分清楚. 由于NS5A表现出对抗干扰素α(IFNα)的治疗效应而引起人们广泛的关注, NS5A能够与肝细胞中的IFN刺激蛋白-双链RNA依赖的激酶(PKR)相互作用, 抑制PKR的功能, 从而下调IFN刺激的抗病毒效应[7-8].

基因表达谱芯片是将大量的基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块基因芯片上, 对来源不同的个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下的细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行检测, 从而大规模对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合分析和判断, 本研究应用基因表达谱芯片NS5ATP9对HepG2 细胞基因表达谱差异的检测, 发现16个差异表达的基因, 表达增强的基因有3条. 表达降低的基因有13条. 表达变化显著的基因, 涉及细胞信号传导、免疫调节、炎症反应、肿瘤的发生、能量代谢等生物过程, 说明NS5ATP9具有多种生物学调节功能.

分析表达增强的基因, NY-REN-62与人肿瘤自身抗体IgG有关, FMR1基因变异可导致精神发育迟缓脆性X染色体综合征, 表现为中\重度发育迟缓, 大耳, 颌隆凸, 高声调等症状. TXNRD1是硫氧还蛋白家族的成员. 此蛋白准确功能还未知, 但他与细胞分化有关. 表达降低的基因主要有: NF-κB在生理和病理状态下表达的细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞黏附分子和急性时相蛋白都能检测到. 能被细胞因子、氧自由基、吸入颗粒、紫外线照射、细菌及病毒产物激活. 异常激活后相关炎症因子与自身免疫关节炎、哮喘、感染性休克、肺纤维症、肾小球肾炎、动脉粥样硬化的发生有关. 相反, 完全持续的抑制直接与凋亡、异常免疫细胞的发育有关系[9-17]. L-谷氨酸盐是中枢神经系统主要兴奋神经递质, 激活亲代谢性谷氨酸盐受体. 谷氨酸神经递质参与正常脑功能的许多方面活动, 干扰神经病理发生过程[18-21]. CYP2D6基因编码细胞色素 P450超家族酶. 细胞色素 P450蛋白是单加氧酶, 参与药物代谢, 胆固醇、类固醇、脂类合成. 他位于内质网, 通常药物代谢的20%由他完成[22-24]. 4-氨基丁酸氨基转移酶(ABAT)对-氨基丁酸起分解代谢的作用, 抑制神经递质转化为琥珀酸半醛. ABAT cDNA编码500个氨基酸蛋白. 大约人类1/3的突触能检测到GABA. ABAT在肝、脑受2个共显性等位基因的调控. ABAT缺乏型包括精神发育迟缓, 张力减退, 反射亢进, 嗜睡, 癫痫发作, EEG异常[25-27]. TIMP1编码蛋白是基质金属蛋白酶的天然抑制因子. 这个基因位于突触蛋白I基因的内含子6区, 进行反转录. TIMP1在转录水平上应答细胞因子和激素的诱导分子. 而且, 一些未完全失活的X染色体表达提示: 这个基因的灭活方式在女性中是多种多样的[28-31]. 这些提示NS5ATP9作用是相当复杂的.

因基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到两组组织或细胞基因表达谱的差异, 故在HCV感染及其致癌机制的研究中具有重要的应用价值. 本实验我们用分子生物学技术构建了NS5ATP9的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP9, 并用空载体作为阴性对照, 利用脂质体转染HepG2细胞, 之后从中提取总RNA, 逆转录为cDNA, 进行基因芯片技术分析. 结果表明, 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导、免疫调节、肿瘤发生等基因. 我们下一步将对这一未知蛋白进行更深入的研究. 总之, 本研究的结果表明, NS5ATP9对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 他为我们进一步深入研究NS5ATP9的功能奠定基础.

编辑: N/A

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