研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2004-12-15; 12(12): 2880-2882
在线出版日期: 2004-12-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i12.2880
酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因
蔺淑梅, 陈天艳, 成军, 王琳, 梁耀东, 李克, 张树林
蔺淑梅, 陈天艳, 成军, 王琳, 梁耀东, 李克, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-05-28
修回日期: 2004-08-25
接受日期: 2004-09-30
在线出版日期: 2004-12-15

目的: 用酵母双杂交技术筛选白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白的基因.

方法: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV核心蛋白编码基因, 连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落, 增菌后提出质粒, 转化入大肠杆菌(DH5α), 提出质粒并测序, 进行生物信息学分析.

结果: 成功克隆出HBV核心蛋白编码基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个, 其中肿瘤高甲基化1基因3个, 编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个, 乙酰辅酶A合成酶3基因1个, 假定翻译起始因子基因1个, 趋化因子受体5基因1个, 线粒体核糖体蛋白L41基因1个, Kyot结合蛋白基因1个, Ran结合蛋白基因1个, 真核细胞翻译延伸因子2基因2个, 未知基因5个.

结论: 成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白, 为进一步研究HBV 核心蛋白在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.

关键词: N/A
引文著录: 蔺淑梅, 陈天艳, 成军, 王琳, 梁耀东, 李克, 张树林. 酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因. 世界华人消化杂志 2004; 12(12): 2880-2882
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: May 28, 2004
Revised: August 25, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: December 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种严重危害人类健康的致病病毒因子, 除引起急、慢性病毒性肝炎, 慢性肝炎迁延不愈, 导致肝纤维化(LC), 还与肝细胞癌(HCC)的发生密切相关[1]. HBV属嗜肝DNA病毒, 基因组为3 200千碱基对(kb)部分双链环状DNA. HBV有2个核心相关的开放读框, 其中核心蛋白基因编码21 ku的HBcAg. HBcAg有高度免疫原性, 几乎所有HBV感染者都产生抗-HBc, 同时有T细胞免疫应答[1-2]. HBV的蛋白与肝细胞和白细胞中的蛋白之间的相互作用在HBV感染、慢性肝炎和致肝细胞癌过程中起着重要的作用. 我们曾用酵母双杂交技术筛选了肝细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合蛋白的基因, 证明HCV核心蛋白与肝脏脂肪变的关系, 为探讨HCV致病的分子生物学机制提供了重要线索[3-6]. 为进一步研究HBV与免疫系统的关系, 我们用酵母双杂交技术筛选白细胞中与HBcAg结合蛋白基因.

1 材料和方法
1.1 材料

Saccharomyces cerevisiae AH109酵母株、Y187酵母株(K1612-1)、cDNA白细胞文库、以上产品均购自Clontech公司. 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade, X-α-半乳糖苷酶(Gal)等购自Clontech公司, 半硫酸腺苷、醋酸锂购自Sigma公司. 复杂高效感受态(FSB), 本室自制. 大肠杆菌(DH5α), 本室保存.

1.2 方法

1.2.1 诱饵质粒的构建及表达: HBV核心蛋白基因的酵母表达载体pGBKT7-HBV core用醋酸锂法转入酵母细胞AH109由本室构建.

1.2.2 酵母白细胞文库的构建: cDNA白细胞文库进行增菌后, 提出质粒, 转化入酵母细胞(Y187), 经文库滴定, 确定文库细胞计数大于1×1012细胞/mL.

1.2.3 诱饵与白细胞文库的酵母配合: 挑取在SD/-Trp选择培养基上生长转化子(计数大于1×1012细胞/mL)与白细胞文库混合, 30 ℃轻摇配合过夜, 24 h后铺板SD/-Trp/-Leu/ -His 25块、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade(QDO)25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 生长16 d后把长出的大于3 mm的酵母集落, 在铺有 X-α-半乳糖苷酶的QDO上检查α-半乳糖苷酶活性, 认为在QDO培养基上生长且出现蓝色菌落的配合为阳性集落.

1.2.4 阳性质粒的克隆和分析: 挑取真正的阳性集落按照试剂盒提供的操作指南Lyticase法提取酵母质粒. 提取的质粒以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的SOB平板培养, 所获得的菌落酶切鉴定后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank比对, 进行生物信息学分析, 并把所获新的基因存入GenBank数据库.

2 结果

cDNA测序与同源性分析初步结果配合后筛选出既能在4缺(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal 的4缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个克隆并测序, 与GenBank数据库进行初步比较, 发现其中含肿瘤高甲基化1基因3个, 编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个, 乙酰辅酶A合成酶3基因1个, 假定翻译起始因子基因1个, 趋化因子受体5基因1个, 线粒体核糖体蛋白L41基因1个, Kyot结合蛋白基因1个, Ran结合蛋白基因1个, 真核细胞翻译延伸因子2基因2个, 未知蛋白基因5个(表1).

表1 阳性克隆与GenBank同源序列比较.
同源蛋白质同源性(%)相同克隆数
肿瘤高甲基化1(HIC1)98-1003
编码线粒体蛋白的DNA聚合酶g(POLG)991
乙酰辅酶A合成酶3991
假定翻译起始因子991
趋化因子受体51001
线粒体核糖体蛋白L411001
Kyot结合蛋白991
Ran结合蛋白(RanBPM)991
真核细胞翻译延伸因子21002
未知蛋白97-1005
3 讨论

乙型肝炎病毒(HBV)基因组中的核心基因以第一和第二个开始密码子ATG分为前-C和C区, 前-C区的ATG在1 841 nt, C区ATG在1 901 nt, 前-C与C区有共同的终止密码子, 在2 458 nt. HBcAg有保守的三维结构, 分子质量21 ku. 其1-144 aa是核壳装配区, 而羧基端的150-185 aa段是精氨酸富集区. HBcAg的羧基末端是与RNA/DNA的结合区段, 而且受细胞激酶作用而部分磷酸化, 磷酸化对核心内DNA合成、复制和传染的建立很重要. HBcAg有鱼精蛋白样亲胞核性羧基末端, 可介导细胞核内转运信号, 大量HBcAg进入细胞核内[7-9].

酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下的相互作用提供了一种新的遗传学方法. 酵母双杂交系统通过将两个推定有相互作用的蛋白X和Y分别融合到一酵母转录激活因子的结合结构域(BD)和激活结构域(AD)上, X与Y的相互作用重构了激活因子, 从而导致下游"报告基因"的转录, 产生容易探测到的表型. 我们使用的是酵母双杂交系统3(Clontech公司商品化的双杂交系统), 由于有3个表达基因用来筛选及严格的对照, 其阳性率达95%以上, 假阳性率5%以下[10-14].

实验中我们在真核表达载体pGBK-T7中构建pGBKT7-HBV core诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了HBV核心蛋白基因, 与人白细胞cDNA文库的酵母菌株Y187进行配合, 筛选出与之相互作用的蛋白基因17种, 其中肿瘤高甲基化基因(HIC1)是肿瘤抑制基因的代表, 在正常组织活跃表达, 而在各种肿瘤细胞表达低下, 与17p13.3的CpG岛联合使其异常高甲基化及在多种常见人类肿瘤HIC1转录失活 [15], HBcAg可与之结合, 表明HBcAg可能与HCC的发生有关. 人线粒体DNA是16 569 bp的双链DNA, 编码的13个蛋白产物为氧化磷酸化用来合成真核细胞所需的ATP, 而编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ(POLG)是惟一的参与合成mtDNA的聚合酶, POLG由于校正效率的降低而有错误倾向, 由于变异、外因和某些抗病毒药物抑制, POLG的活性缺陷可增强mtDNA的变异[16-18]; 另外HbcAg可与线粒体核蛋白L41结合, 这些都支持HBV核心蛋白通过肝细胞线粒体介导HBV的复制和装配. 乙酰辅酶A合成酶是用来合成脂肪酸, 在肝线粒体外膜、微粒体、细胞质膜和过氧化物酶发现有活性表现, 乙酰辅酶A合成酶活性依赖某些外因, 如用去垢剂处理微粒体和过氧化物酶可诱导抑制乙酰辅酶A合成酶[19-20]. 趋化因子受体5(CCR5)主要表达于单核细胞, 也选择性表达于Th1细胞. 有人报告, CCR5尽管都表达在活化的效应性Th1、Th2细胞上, 强度亦相仿, 但仍认为CCR5是Th1细胞的标志, 人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)通过CD4分子作为第一受体, 以趋化因子受体CXCR4、CCR5等作为第二受体实现其对靶细胞的感染, 并导致HIV感染细胞之间发生融合, 形成合胞体, 这是HIV在体内进行扩散的主要形式, 也是HIV感染导致机体CD+4细胞绝对数下降的一个重要原因[21]. Kyot结合蛋白(KBP)基因至少编码三个转录本(KBP1、KBP2、KBP3), 三个转录本与Kyot结合的区域和能力是一样的, 说明三者的功能一样, 通过酵母双杂交证明Kyot2和KBP相互作用, 而且Kyot通过其LIM区域介导二者结合, LIM区域是半胱氨酸富集的锌结合基序, 参与蛋白之间的结合, LIM蛋白能和受体酪氨酸激酶和蛋白激酶C(PKC)结合, 可能参与信号转导, LIM区域作为接头分子促进蛋白复合体的形成, KBP与Kyot的LIM区域结合, 说明KBP可能参与调节Kyot的功能[22]. Ran是 Ras样核GTPase, 参与核质转运、微管装配及核膜形成[23-24], RanBPM是位于细胞中心的蛋白, 作为Ran结合蛋白参与核质的转运过程[25]. 未知功能新基因的发现也为我们研究HBV的致病作用提供了新线索, 但需要进一步研究证实.

通过本次实验我们得知HBcAg能与多种蛋白相结合, 其中包括几种免疫因子, 使我们进一步了解了HBV病毒与免疫系统的相互关系. 通过以上结果提供的这些线索, 我们可以进行更深入的研究, 进一步弄清各种与HBcAg结合的蛋白及作用机制, 为阻断HBV感染及肝细胞癌(HCC)发生探索新道路.

编辑:N/A

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