基因表达谱芯片技术筛选TAHCCP1转染细胞差异表达基因

摘要

目的: 应用基因芯片技术, 检测丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式激活基因TAHCCP1的表达对肝母细胞瘤细胞系HepG2基因表达谱的影响, 进一步阐明TAHCCP1在肝细胞中上调或下调的基因, 探索其可能的调节功能.

方法: 设计并合成TAHCCP1基因序列特异性的引物, 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1基因片段, 以常规的分子生物学技术将获得的TAHCCP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA, 逆转录为cDNA, 应用基因表达谱芯片技术对两组间差异表达mRNA进行检测和分析.

结果: 在筛选的1 152点cDNA芯片中, 有110种基因的表达水平上调(占9.55%), 98种基因的表达水平下调(8.51%), 包括一些与体内免疫调节、脂类代谢、蛋白质的翻译合成、氧化反应、细胞凋亡及细胞内的信号传导方面的基因.

结论: 应用基因表达谱芯片成功筛选了TAHCCP1转染细胞后差异表达基因, 为进一步阐明TAHCCP1蛋白可能的生物学功能提供依据.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: May 28, 2004
Revised: August 25, 2004
Accepted: September 30, 2004
Published online: December 15, 2004

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

TAHCCP1是本室利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)筛选到的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白反式调节的新靶基因, 该新基因的编码序列全长为2 001个核苷酸(nt), 编码产物由667个氨基酸残基(aa)组成, 在GenBank中注册号为AY038359[1-4]. 该蛋白在细胞内的生物学功能未知, 为了探索TAHCCP1的功能, 我们构建了TAHCCP1基因真核表达载体, 应用基因表达谱芯片技术筛选、克隆TAHCCP1上调或下调的基因, 推测其在体内的功能, 为研究HCV核心蛋白的致病机制及探索未知基因的功能提供了新的方向.

1 材料和方法

1.1 材料

肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞由本室保存, 细胞培养相关试剂、总RNA提取试剂Trizol及真核表达载体pcDNA3.1(-)均购自Invitrogen公司. 人类基因组分类I芯片包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、细胞信号转导相关基因等1 152个cDNA, 由上海联合基因有限公司提供. mRNA纯化试剂Oligotex mRNA Midi Kit 购自Qiagen公司.

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体构建及细胞转染: 设计并合成TAHCCP1基因序列特异性引物, 上下游引物序列分别为: 5'-GAT ATC CGC AGA AAT GGA GCA AGA GC-3', 5'-GGA TCC GTG ATT CCC AGC ACT TCA TC-3', 下划线部分为引物两端的酶切位点, EcoR V和BamH I. 以转染了HCV核心表达质粒的HepG2细胞cDNA作为模板, 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增TAHCCP1的全长编码基因. 依次克隆到TA载体中进行序列测定及真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1. 在35 mm培养皿中常规培养HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂Lipofectamine PLUS将2 μg pcDNA3.1(-)-TAHCCP1和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×10⁶个细胞加入1 mL Trizol试剂, 立即于液氮中保存.

1.2.2 总RNA提取及mRNA纯化: Trizol试剂一步法提取转染pcDNA3.1(-)-TAHCCP1和空载体pcDNA3.1(-)的细胞HepG2总RNA(分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化. 纯化mRNA并行电泳检测.

1.2.3 探针标记及芯片制备: 常规方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg), 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中. 芯片包含的1 152个cDNA以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.4 杂交及洗涤: 将基因芯片和杂交探针在95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h, 依次以2×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC+2 g/L SDS、1 g/L×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.5 检测与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>2.000, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3<0.500, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果

2.1 pcDNA3.1(-)-TAHCCP1的表达载体构建

TAHCCP1真核表达质粒pcDNA3.1(-)-TAHCCP1经限制性内切酶分析和核苷酸序列测定, 证实含有TAHCCP1完整的开放读码框架, 序列准确无误.

2.2 总RNA及mRNA的定性、定量分析

实验组和对照组总RNA的吸光度比值A₂₆₀/A₂₈₀分别为1.898和1.912, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA, mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.3 芯片杂交体系验证及结果分析

在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交技术体系的整个过程, 在芯片上设置了阴性对照(8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性. 由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异. 按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共208条, 其中110条基因表达增强, 98条基因表达降低.

2.4 差异表达基因分析

TAHCCP1上调基因类型: 在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为TAHCCP1的上调基因. 在我们的研究中发现有110种基因的表达水平上调, 表1列出部分上调基因. TAHCCP1基因下调基因: 在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为TAHCCP1的下调基因. 在我们的研究中发现有98种基因的表达水平下调, 表2列出部分下调基因.

表1 TAHCCP1上调的部分基因.

序号	GenBank登录号	编码蛋白	Cy5/Cy3
1	NM_001226	凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶6(CASP6)	2.173
2	NM_006101	肿瘤中高表达的富含亮氨酸的蛋白(HEC)	2.314
3	NM_025190	丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活蛋白6(NS3TP6)	2.403
4	NM_004661	CDC23细胞周期分裂蛋白(CDC23)	2.503
5	NM_000857	鸟苷酸环化酶1(GUCY1B3)	2.829
6	NM_014225	蛋白磷酸酶(PPP2R1A)	2.981
7	NM_005637	分泌滑液的肉瘤转位蛋白(SS18)	3.159
8	NM_003202	转录因子7(TCF7)	3.368
9	NM_003330	硫氧还蛋白还原酶(TR)	3.459
10	NM_053274	FKBP相关蛋白48(FAP48)	3.614
11	NM_002736	cAMP依赖的蛋白激酶(PRKAR2B)	4.534
12	NM_001961	真核翻译延伸因子2(EEF2)	5.105

表2 TAHCCP1下调的部分基因.

序号	GenBank登录号	编码蛋白	Cy5/Cy3
1	NM_003142	La自身抗原	0.267
2	NM_001551	免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)	0.269
3	NM_002624	预折叠蛋白5(PFDN5)	0.289
4	NM_002292	层粘连蛋白(LAMB2)	0.323
5	NM_005950	金属硫蛋白(MT1G)	0.347
6	NM_005627	血清/糖皮质激素调节激酶(SGK)	0.350
7	NM_000581	谷胱甘肽过氧化物酶(GPX1)	0.350
8	NM_003790	肿瘤坏死因子受体超家族成员12(TNFRSF12)	0.373
9	NM_006609	丝裂素活化的蛋白激酶激酶激酶2(MAP3K2)	0.381
10	NM_003254	组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP1)	0.412
11	NM_002166	DNA结合的显性负相螺旋环螺旋蛋白(ID2)	0.412
12	NM_001350	死亡相关蛋白6(DAXX)	0.417
13	NM_033306	凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶4(CASP4)	0.420
14	NM_021138	TNF受体相关因子2(TRAF2)	0.432
15	NM_012317	肿瘤中下调的亮氨酸拉链蛋白(LDOC1)	0.451
16	NM_006098	鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(GNB2L1)	0.452
17	NM_012341	G蛋白结合蛋白(CRFG)	0.473

3 讨论

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是HCV基因组编码的一种最为重要的具有多种生物学活性的结构蛋白质, 与HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[5-10]. 核心蛋白是一种作用很强的转录激活因子, 能够影响细胞信号转导途径, 激活多种病毒及细胞基因启动子, 调控着细胞基因的转录[11-15]. 我们利用抑制性消减杂交技术, 对于表达HCV核心蛋白表达载体转染的HepG2细胞进行研究, 结合生物信息学技术克隆了核心蛋白反式激活作用的新靶基因, 命名为TAHCCP1, 该基因的细胞内生物学功能未知.

基因表达谱芯片技术可快速有效地检测到两组组织或细胞基因表达谱的差异, 在研究新基因的功能上显示出其优越性[16-18]. 我们用常规分子生物学技术构建了TAHCCP1的真核表达载体pcDNA3.1(-)-TAHCCP1, 并用空载体作为阴性对照, 利用脂质体转染HepG2细胞, 提取总RNA, 逆转录为cDNA, 进行基因芯片技术分析. 结果表明, 在筛选的1 152个cDNA中, 有110个基因表达水平上调, 98种基因的表达水平下调, 其中包括一些未知功能的基因.

在上调的基因中, NS3TP6是丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活蛋白6, TAHCCP1对其表达水平上调, 表明HCV感染靶细胞后病毒不是孤立存在的, 病毒编码蛋白与肝细胞蛋白、肝细胞蛋白与肝细胞蛋白之间存在复杂的相互调节作用[19]. 细胞分裂周期蛋白CDC23与酿酒酵母的CDC23高度同源, 是促进细胞分裂后期复合物(anaphase-promoting complex, APC)的成员, 对于细胞周期由G2期向M期过渡是必不可少的. APC能够催化细胞周期蛋白B与泛素(cyclin B-ubiquitin)形成共轭复合物, 在泛素介导的细胞周期蛋白B的蛋白水解过程中起重要作用, 推测TAHCCP1通过上调CDC23的表达对细胞周期有调控作用[20]. 蛋白磷酸酶, 为钙依赖的磷酸酶, 对T细胞的激活非常重要, 其表达升高可能与机体的免疫功能相关[21]. 硫氧还蛋白还原酶(TR)是硒蛋白质, 为嘧啶核苷氧化还原酶家族成员之一, 能够还原催化硫氧还蛋白及其他底物, 调节细胞内多种氧化还原作用敏感蛋白, 在硒元素新陈代谢和保护电离辐射诱导的氧化应激及随之增强的转录因子AP-1 DNA结合活性过程中起重要作用. 在β-干扰素/全反式维甲酸诱导细胞凋亡过程中, TR是关键的调节因子, TR可迅速诱导细胞凋亡, 研究发现羧基末端表面功能域缺失突变的TR可以组成型激活TR依赖的细胞凋亡应答, 促进p53依赖的基因表达, 抑制细胞生长调节[22]. 此外, TAHCCP1对真核翻译延伸因子2的表达水平显著上调, 高达5倍, 提示TAHCCP1促进蛋白质的翻译合成[23].

下调的基因中, 人La自身抗原, 能够与HCV 5'-非翻译区的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)相互作用, 刺激IRES介导的HCV翻译. TAHCCP1通过下调La自身抗原表达水平, 反馈调节HCV基因组的翻译[24]. 免疫球蛋白结合蛋白1(IGBP1)为B细胞信号转导分子α4, 参与B细胞增生分化以及B细胞受体复合物介导的多种信号转导途径, 在机体的体液免疫应答过程中发挥至关重要的作用, 在表达TAHCCP1的细胞, IGBP1分子水平显著下调, 提示免疫功能低下, 这与HCV感染患者免疫功能低下的临床表现是一致的[25]. 预折叠蛋白是辅助其他蛋白正确折叠和有效组装的伴侣蛋白, 该蛋白的第五亚单位蛋白前折叠素5(prefoldin)可与原癌基因c-myc相互结合, 抑制c-myc的转录活性, 被公认为是候选的肿瘤抑制基因. 可见, TAHCCP1下调肿瘤抑制基因前折叠素5的表达, 间接激活原癌基因c-myc的转录, 参与HCV核心蛋白的肝细胞恶性转化机制[26]. 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)是体内抗氧化损伤的重要酶, 参与过氧化氢解毒作用. 在培养的胸部肿瘤细胞中, 该酶能够保护CD95诱导的细胞凋亡[27]. MAP3K2是丝氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族成员之一, 优先活化参与MAP激酶信号途径的一些激酶, 包括MAPK7和MAP2K4. MAP3K2能够直接磷酸化并激活IκB激酶(IKKs), 在核转录因子NF-κB信号转导途径中起重要作用. 该激酶也能够结合并活化蛋白激酶C相关的激酶2(PRKCL2/PRK2), 参与PRKCL2调节的信号过程[28]. 凋亡相关的半胱氨酸蛋白酶胱冬肽酶4是半胱氨酸-精氨酸蛋白酶家族成员, 胱冬肽酶家族酶的依次活化, 在细胞凋亡的各时相起着至关重要的作用[29]. 可见, TAHCCP1下调上述基因的表达, 参与细胞信号转导途径.

总之, TAHCCP1在体内免疫调节、氧化还原代谢、信号转导、蛋白质的翻译合成方面可能具有一定的作用, 可能参与细胞凋亡及细胞内的信号传导功能的调控. 作为人体中正常存在的基因, 其具体的功能尚需要近一步研究来证实.

备注

编辑:N/A

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