修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15
目的: 为研究未知功能的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原(HBcAg)结合蛋白C-12的生物学功能, 我们应用基因芯片技术对于C-12转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析, 探索该基因表达对细胞基因表达的影响.
方法: 应用酵母双杂交技术筛选并验证HBcAg的肝细胞结合蛋白基因. 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从HepG2细胞中扩增C-12蛋白编码基因片段, 经测序鉴定后构建表达载体 pcDNA3.1(-)-C-12. 以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.
结果: 筛选出肝文库中HBcAg结合蛋白新基因C-12, 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定正确. 提取转染细胞的总mRNA并逆转录成为cDNA, 进行DNA芯片技术分析. 在1 159个基因表达谱的筛选中, 发现有16个基因表达水平显著下调, 包括胰岛素受体、丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂、SUMO-1活化酶亚基1、肿瘤易感基因101、磷酸硒合成酶2 (SPS2)、caspase 4凋亡相关半胱氨酸蛋白酶4、急性淋巴细胞性白血病易位子T、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、DEAD box蛋白多肽21、前折叠素5 (Prefoldin 5)、丝氨酸棕榈酰转移酶、G蛋白通路抑制剂、肿瘤坏死因子受体相关蛋白、转化生长因子1、ADP-核糖基转移酶及1个未知蛋白基因; 1个未知功能蛋白编码基因的表达水平显著上调.
结论: C-12基因的表达对于肝癌细胞基因表达谱有显著影响, 基因表达谱芯片技术是探索基因功能的有效技术途径, 实验结果为进一步阐明C-12与HBcAg结合后的肝细胞生物学变化提供了有力的依据.
引文著录: 陆荫英, 刘妍, 成军, 梁耀东, 陈天艳, 邵清, 王琳, 张玲霞. HBsAg结合蛋白C-12基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 62-65
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004
AIM: To study the biological function of a novel hepatitis B virus core antigen binding protein C-12, and to analyze the gene expression profiles of HepG2 cell transfected with C-12 gene.
METHODS: C-12 gene was screened and identified by using yeast two-hybrid system 3 technique. Full-length encoding frame C-12 and its amino acid sequences was identified using bioinformatics method and the recombined eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1(-)-C-12 was constructed. cDNA microarray technology was employed to detect the mRNA from HepG2 cells transfected with pcDNA3.1(-)-C-12 and pcDNA3.1(-), respectively.
RESULTS: According to yeast two-hybrid screening and the bioinformatics analysis results, C-12 cDNA sequence was identified. Among 1152 genes, there were 17 differences, of which 16 genes were upregulated and 1 gene were downregulated in HepG2 cells transfected with C-12 protein expression plasmid. These genes differentially regulated by C-12 protein included human genes encoding proteins involved in cell signal transduction, cell proliferation and differentiation, and cell growth regulation.
CONCLUSION: Overexpression of C-12 affects the expression profile of HepG2 cells. The results prove some clues for further clarifying the molecular biology processes of hepatocytes during the interaction between HBV core protein and C-12.
- Citation: Lu YY, Liu Y, Cheng J, Ling YD, Chen TY, Shao Q, Wang L, Zhang LX. Gene expression profile of HepG2 cell transfected with a novel gene C-12 coding for HBcAg binding protein. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(1): 62-65
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i1/62.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i1.62
乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)具有保护病毒mRNA, 防止其被RNA酶降解的作用, 对于乙肝病毒前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成具有重要的作用, 还参与介导机体的免疫反应, 在病毒致病过程中起着重要的作用[1-6]. 肝炎病毒蛋白与宿主蛋白相互作用, 是病毒感染导致肝细胞损伤、肝纤维化和肝细胞癌发生、发展的重要原因, 研究HBcAg与肝细胞蛋白之间的相互作用, 有助于更好地理解HBV的致病作用.我们采用酵母双杂交系统3, 以HBcAg作为"诱饵", 从肝细胞cDNA文库"钓"出一未知蛋白C-12. 为进一步探索该基因的功能, 我们应用基因表达谱芯片技术(cDNA microarray)筛选C-12表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因, 并进行分析, 为全面了解C-12基因在肝细胞中的生物过程提供理论基础.
HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109 (本室保存), Taq DNA 聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I、BamH I和Pst I等限制性内切酶购于Takara生物公司, pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS 转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega), 新基因E-36扩增引物(P3 5'- GAATTCATGTCCTATCCAGCCCTTCACCAG-3', P4 5'-GGATCCTCAGCAGCAGGCGGAAA CGCTCGTC-3')由合成及DNA测序由上海博亚公司承担.
1.2.1 HBcAg结合蛋白的酵母双杂交筛选: 应用酵母双杂交技术筛选HCV核心蛋白结合的肝细胞蛋白的研究原理、方法、操作步骤以及C-12基因真核表达载体的构建等参考基因治疗研究中心相关的研究论文[7-13].
1.2.2 总RNA提取及mRNA纯化: 在35 mm培养皿中常规培养肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞, 细胞生长至对数期时, 分别以脂质体转染试剂Lipofectamine PLUS将2 g pcDNA3.1(-)-C-12和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞, 48 h后收获细胞, 每5×106个细胞加入1 mL TRIzolRNA提取试剂. 立即于液氮中保存. 使用TRIzol试剂一步法提取pcDNA3.1(-)-C-12和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA (分别标记为实验组和对照组), 样品经分光光度计检测吸光度A值, 并行热稳定实验, 于-20 ℃和70 ℃保温1 h后, 经琼脂糖凝胶电泳检测28 S、18 S条带变化. 以Qiagen公司Oligotex mRNA Midi Kit纯化得Mrna(操作按说明书进行), 并行电泳检测.
1.2.3 探针标记及芯片制备: 逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 g), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 g). 乙醇沉淀后溶解在20 L 5×SSC+2 g/L SDS杂交液中.芯片包含的1 152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 g/L溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7 500 点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样.玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), UV交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L 的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
1.2.4 杂交及洗涤: 将基因芯片和杂交探针95 ℃水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 ℃杂交15-17 h. 依次以2×SSC+2g/L SDS、0.1×SSC +2 g/L SDS、0.1×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
1.2.5 检测与分析: 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3>1.8, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3 <0.7, 为绿色荧光, 显示表达减低.
提取pcDNA 3.1(-)-C-12和空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞总RNA, 测得吸光度A260/A280>1.90, 热稳定实验70 ℃保温1 h与-20 ℃ 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.
在芯片上共有1 152个cDNA. 为了监控芯片杂交技术体系的整个过程, 在芯片上设置了阴性对照 (8条水稻基因, 共8个点), 这些点的杂交信号均很低, 证实了数据的可靠性.由于实验组探针标记Cy5荧光素(呈红色), 对照组探针标记Cy3荧光素(呈绿色), 红绿颜色的差异就显示该基因在实验组和对照组中基因表达水平上的差异, 黄色代表表达水平无差异.按阳性标准, 从1 152个基因中筛选出差异表达基因共20条, 其中13条基因表达增强, 7条基因表达降低.
在1152个基因中筛选出17个差异表达的基因, 除一个未知基因表达上调外, 其余16种基因的表达下调, 提示C-12的过表达对HepG2细胞中的这些蛋白表达有抑制作用.这些差异表达基因大多与细胞信号转导、细胞增生分化、肿瘤发生等生物过程密切相关, 如相关肿瘤发生相关基因如肿瘤易感基因101、急性淋巴细胞性白血病易位子T等; 细胞生长调节及细胞信号转导相关基因, 如G蛋白通路抑制剂、丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂、caspase 4、肿瘤坏死因子受体相关蛋白、转化生长因子、丝氨酸棕榈酰转移酶等及DNA复制及翻译相关基因如DEAD box蛋白多肽21等; 过氧化酶相关基因如ADP-核糖基转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶4、磷酸硒合成酶2 等(表1).
| GenBank号(NM) | 编码蛋白 |
| 000208 | 胰岛素受体 |
| 005500 | SUMO-1活化酶亚基1 |
| 006292 | 肿瘤易感基因101 |
| 012248 | 磷酸硒合成酶2 (SPS2) |
| 006217 | 丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制剂 |
| 033306 | caspase 4凋亡相关半胱氨酸蛋白酶4 |
| L04731 | 急性淋巴细胞性白血病易位子T |
| 002085 | 谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4) |
| 004728 | DEAD box蛋白多肽21 |
| 002624 | Prefoldin 5 |
| 006415 | 丝氨酸棕榈酰转移酶 |
| 004127 | G蛋白通路抑制剂 |
| 016614 | 肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TTRAP) |
| 000660 | 转化生长因子(TGF1) |
| 006437 | ADP-核糖基转移酶 |
| AK027136 | 未知蛋白 |
基因表达谱芯片技术是近年来新发展起来的一项研究差异基因表达的分子生物学前沿技术, 通过将大量的基因特异的探针或其cDNA片段固定在一块固相载体上, 与待测样品杂交后用激光共聚焦荧光检测系统进行结果扫描、检测, 对来源不同的个体、组织、发育阶段、分化阶段、病变及刺激条件下的细胞内的mRNA或cDNA进行分析, 获得大量有价值的生命信息[16-20]. 该技术解决了传统核酸杂交技术操作复杂、检测目的基因少、低通量的缺点, 能一次进行大量的信息分析, 在各种的疾病的诊断、基因突变分析、病原体检测、治疗药物筛选、疾病发生发展的分子生物学机制研究等方面具有广泛的应用价值.本研究应用基因表达谱芯片技术, 对肝细胞cDNA文库中未知功能的HBcAg结合蛋白新基因C-12表达质粒pcDNA3.1(-)-C-12和空载体对照分别转染的HepG2细胞差异表达的mRNA进行检测, 通过分析二者之间基因表达的差异信息, 寻找C-12反式调节的基因.在1152个基因中筛选出17个差异表达的基因, 其中16个是表达减低的基因, 与细胞信号转导、细胞增生分化、肿瘤发生及氧化还原有关.
在受C-12表达影响下调的基因中, SUMO-1活化酶能催化SUMO-1(一种泛素的类似物)结合并修饰RanGAP1, PML, Sp200 及 I kappa B alpha等转录因子[21-23].DEAD box蛋白因含有保守的Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD)序列, 是一种推定的RNA解旋酶, 与许多细胞过程有关如改变RNA二级结构包括转录起始、细胞核及线粒体的分裂、核糖体和剪接体的聚合等, 影响着诸如胚胎发育、精子发生、细胞生长、分化等活动. 该蛋白可以使双链RNA解旋、使单链RNA折叠, 并在核糖体RNA的产生、RNA编辑、RNA转运以及普通转录过程中发挥重要作用[24]. 前折叠素(Prefoldin)是分子伴侣家族中的一员, 是伴侣蛋白(chaperonin)介导的蛋白质折叠过程中一个重要的中间物质, 他能捕获并转运胞质中未折叠的目的蛋白, 使其特异性地与伴侣蛋白结合, 介导蛋白质的正确折叠和成熟[25-29].
肿瘤易感基因(TSG101 tumor susceptibility gene)在纤维母细胞中的表达产物的失活可以引起细胞发生转化, 导致裸鼠发生转移性肿瘤. 而人的TSG101基因位于11号染色体的15.1-15.2长臂上, 该区域被推断含有肿瘤抑制基因, 有研究证实在乳腺癌组织中发现TSG101的等位基因有缺失突变, 而正常的乳腺组织中则没有[30].急性淋巴细胞性白血病基因(ALL-1)位于第11号染色体的23号长臂上, 在急性白血病时该基因出现中间缺失突变或与第1、4、6、9、10、19号染色体的相应区域发生交互转位, 且该基因的异常变化可以引起一些特殊的肿瘤融合蛋白的产生[31]. 抑制过氧化酶相关基因如ADP-核糖基转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶4、磷酸硒合成酶2 等, 可以干扰细胞的能量代谢, 引起细胞炎症坏死. C-12新基因的表达可抑制以上基因的表达, 提示C-12蛋白可能参与细胞转录和蛋白合成、肿瘤发生及细胞的能量代谢等多方面的作用.
总之, 利用基因表达谱芯片对C-12蛋白差异调节基因的表达研究表明, 细胞内C-12蛋白的过表达引起的生物过程涉及许多不同基因表达的变化, 这些基因与细胞增生与分化、肿瘤发生、能量代谢及生物转化等生物过程密切相关, 结果为深入了解C-12基因的生物学功能及其与HBV相互作用过程中致病(癌)的分子生物学机制提供重要的线索.
编辑: N/A
| 1. | Pumpens P, Grens E. Hepatitis B core particles as a universal display model: a structure-function basis for development. FEBS Lett. 1999;442:1-6. [PubMed] [DOI] |
| 2. | Le Pogam S, Shih C. Influence of a putative intermolecular interaction between core and the Pre-S1 domain of the large envelope protein on hepatitis B virus. J Virol. 2002;76:6510-6517. [PubMed] [DOI] |
| 3. | Livingston BD, Crimi C, Fikes J, Chesnut RW, Sidney J, Sette A. Immunization with the HBV core 18-27 epitope elicits CTL responses in humans expressing different HLA-A2 supertype molecules. Hum Immunol. 1999;60:1013-1017. [PubMed] [DOI] |
| 4. | Riedl P, Stober D, Oehninger C, Melber K, Reimann J, Schirmbeck R. Priming Th1 immunity to viral core particles is facilitated by trace amounts of RNA bound to its arginine-rich domain. J Immunol. 2002;168:4951-4959. [PubMed] [DOI] |
| 5. | Cao T, Meuleman P, Desombere I, Sallberg M, Leroux-Roels G. In vivo inhibition of anti-hepatitis B virus core antigen (HBcAg) immunoglobulin G production by HBcAg-specific CD4(+) Th1-type T-cell clones in a hu-PBL-NOD/SCID mouse model. J Virol. 2001;75:11449-11456. [PubMed] [DOI] |
| 6. | Lazdina U, Cao T, Steinbergs J, Alheim M, Pumpens P, Peterson DL, Milich DR, Leroux-Roels G, Sallberg M. Molecular basis for the interaction of the hepatitis B virus core antigen with the surface immunoglobulin receptor on naive B cells. J Virol. 2001;75:6367-6374. [PubMed] [DOI] |
| 7. | 李 克, 王 琳, 成 军, 张 玲霞, 段 惠娟, 陆 荫英, 杨 继珍, 刘 妍, 洪 源, 夏 小兵. 酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1. 世界华人消化杂志. 2001;9:1379-1383. [DOI] |
| 9. | 李 克, 王 琳, 成 军, 陆 荫英, 张 玲霞, 李 莉, 刘 妍, 段 惠娟. 丙型肝炎病毒NS2基因酵母双杂交"饵"载体构建及表达. 世界华人消化杂志. 2002;10:129-132. [DOI] |
| 10. | 王 琳, 李 克, 成 军, 陆 荫英, 王 刚, 刘 妍, 钟 彦伟, 段 惠娟, 洪 源. 筛选与克隆肝再生增强因子结合蛋白的基因. 世界华人消化杂志. 2002;10:161-164. [DOI] |
| 12. | 王 琳, 李 克, 成 军, 陆 荫英, 张 健, 陈 天艳, 洪 源, 刘 妍, 王 刚, 钟 彦伟. 酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因. 世界华人消化杂志. 2003;11:385-388. [DOI] |
| 17. | 刘 妍, 成 军, 李 克, 杨 倩, 陆 荫英, 王 琳, 王 建军. 丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析. 世界华人消化杂志. 2003;11:394-398. [DOI] |
| 18. | Zhang MQ. Large-scale gene expression data analysis: a new challenge to computational biologists. Genome Res. 1999;9:681-688. [PubMed] |
| 19. | Yang GP, Ross DT, Kuang WW, Brown PO, Weigel RJ. Combining SSH and cDNA microarray for rapid identification of differentially expressed genes. Nucleic Acids Res. 1999;27:1517-1523. [PubMed] [DOI] |
| 20. | Golub TR, Slonim DK, Tamayo P, Huard C, Gaasenbeek M, Mesirov JP, Coller H, Loh ML, Downing JR, Caligiuri MA. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science. 1999;286:531-537. [PubMed] [DOI] |
| 21. | Okuma T, Honda R, Ichikawa G, Tsumagari N, Yasuda H. In vitro SUMO-1 modification requires two enzymatic steps, E1 and E2. Biochem Biophys Res Commun. 1999;254:693-698. [PubMed] [DOI] |
| 22. | Desterro JM, Rodriguez MS, Kemp GD, Hay RT. Identification of the enzyme required for activation of the small ubiquitin-like protein SUMO-1. J Biol Chem. 1999;274:10618-10624. [PubMed] [DOI] |
| 23. | Gong L, Li B, Millas S, Yeh ET. Molecular cloning and characterization of human AOS1 and UBA2, components of the sentrin-activating enzyme complex. FEBS Lett. 1999;448:185-189. [PubMed] [DOI] |
| 24. | Valdez BC, Henning D, Busch RK, Woods K, Flores-Rozas H, Hurwitz J, Perlaky L, Busch H. A nucleolar RNA helicase recognized by autoimmune antibodies from a patient with watermelon stomach disease. Nucleic Acids Res. 1996;24:1220-1224. [PubMed] [DOI] |
| 25. | Vainberg IE, Lewis SA, Rommelaere H, Ampe C, Vandekerckhove J, Klein HL, Cowan NJ. Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 1998;93:863-873. [PubMed] [DOI] |
| 26. | Agashe VR, Hartl FU. Roles of molecular chaperones in cytoplasmic protein folding. Semin Cell Dev Biol. 2000;11:15-25. [PubMed] [DOI] |
| 27. | Evstigneeva ZG, Solov'eva NA, Sidel'nikova LI. Structure and functions of chaperones and chaperonins. Prikl Biokhim Mikrobiol. 2001;37:5-18. [PubMed] |
| 28. | Braig K. Chaperonins. Curr Opin Struct Biol. 1998;8:159-165. [PubMed] [DOI] |
| 29. | 陆 荫英, 成 军, 张 玲霞. 分子伴侣及其与乙型肝炎病毒的关系. 胃肠病学和肝病学杂志. 2002;11:177-179. |