文献综述 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-09-15; 11(9): 1433-1435
在线出版日期: 2003-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i9.1433
肿瘤多药耐药和进展期大肠癌耐药细胞株建立研究进展
姚学清, 林锋
姚学清, 中国人民解放军第一军医大学南方医院普外科 广东省广州市 510515
林锋, 广东省人民医院胃肠外科 广东省广州市 510082
通讯作者: 姚学清, 510515, 广东省广州市, 中国人民解放军第一军医大学南方医院普外科.
电话: 020-61364623
收稿日期: 2001-10-21
修回日期: 2001-11-10
接受日期: 2001-11-27
在线出版日期: 2003-09-15

目的

综述进展期大肠癌多药耐药细胞株建立的进展.

方法

回顾复习近年的的文献, 了解多药耐药与大肠癌细胞株建立的情况, 并对大肠癌多药耐药细胞株建立的情况进行概括.

结果

多药耐药(MDR)是大肠癌化疗失败的主要原因之一, 建立多药耐药细胞株, 为临床治疗大肠癌奠定的基础.

结论

建立大肠癌耐药细胞株, 为临床克服化疗障碍, 提高大肠癌对化疗药物的敏感性, 对大肠癌治疗起到重要作用.

关键词: N/A
引文著录: 姚学清, 林锋. 肿瘤多药耐药和进展期大肠癌耐药细胞株建立研究进展. 世界华人消化杂志 2003; 11(9): 1433-1435
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: October 21, 2001
Revised: November 10, 2001
Accepted: November 27, 2001
Published online: September 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

大肠癌是消化道常见的恶性肿痛, 其发病率和死亡率在消化道较高. 进展期大肠癌根治性效果差, 手术切除率只有50%左右, 大部分进展期大肠癌术后发生腹腔内复发转移, 5 a生存率只有23-30%. 近年腹腔热灌注化疗[1-3]引起国内外学者广泛的关注, 对术后腹腔内复发转移的防治具有一定的作用, 但多药耐药(multidrug resistance, MDR)是大肠癌化疗失败的主要原因之一, 关于MDR机制的研究及如何克服MDR的问题, 受到国内外广大学者的高度重视, 体外耐药细胞株的建立是研究肿瘤细胞耐药不可缺少的模型, 国内外就耐药机制的研究已建立许多种耐药细胞株, 并以耐药细胞株的建立而筛选MDR逆转剂, 为临床克服化疗障碍, 提高大肠癌对化疗药物的敏感性, 对大肠癌治疗起到重要作用. 本文就MDR发生机制及建立大肠癌耐药细胞株和建株注意问题进行综述.

1 MDR发生机制和MDR逆转

MDR是肿瘤细胞在接触了一种抗癌药物后产生的对其他多种结构与功能迥异的天然药物的耐药[4,7], MDR是肿瘤化疗主要障碍之一, 与之相关的是Pgp, 在Pgp方面的研究逐渐增多, Pgp来自肿瘤细胞, 作为一种独立的能量流出泵(也称ATP流出药泵)导致化疗药物药性降低, MDR1 (multidrug resistance gene)及其产物Pgp能够将化疗药物从肿瘤细胞中泵出, 减少抗肿瘤药物在细胞中聚集.产生MDR机制很多, 其中主要有以下几方面: (1) MDR1 (multidrug resistance gene)基因产物Pgp过度表达; (2)MDR相关蛋白(multidrug resistance-associated protein)过度表达[5]; (3)LRP (lung resistance protein)介导MDR, 使化疗药物在肿瘤细胞聚集降低; (4)拓扑异构酶II(ToPoII)活性降低; (5)谷胱苷肽-S-转移酶(glutatheone S transferase, GST)活性增强; (6)蛋白激酶C(PKC)与MDR表型相关; (7)癌基因c-mcy、C-myb表达减少和C-fos、C-jun表达增加[6]. 从以上MDR机制可以看出, MDR包含非常复杂机制, 目前有些机制尚未明了. 在MDR方面MDR1mRNA和Pgp可能是重要目标. Musto et al [8]研究发现, 人TNF和IL-2在MCT15和MCT116人结肠癌细胞系转导和表达, 可以逆转MDR, TNF和IL-2部分减少mRNA和Pgp水平上MDR1表达(P <0.243). 几种类似方法可以影响Pgp活性, 应用钙通道阻断剂、钙调蛋白等, 或应用各种细胞分裂调节MDR1基因表达, 并且MDR基因表达应视作先天性表达, 说明MDR1基因表达大部贯穿于肿瘤中, 这对肿瘤化疗起着关键作用.有关MDR1基因及其表型的研究基本清楚, MDR1基因克隆及其基因表达已用于临床.根据MDR发生机制, 可以采取以下几种方法来逆转MDR: (1)应用钙通道抑制剂, 使肿瘤细胞内化疗药物聚集增加, 从而增加抗癌药效性; (2)利用单克隆抗体选择性抑制MDR细胞生长, 减少肿瘤细胞MDR; (3)应用MDR细胞对某些药物和环境改变的高度敏感性使MDR逆转. 逆转剂的出现为逆转药物的研究提供了一定理论基础, 同时解决了一些实际问题.Weinstein et al [9] 认为65-68%大肠癌最初是由MDR1 mRNA和Pgp表达的. 最近有关报道, MRP过度表达机制可能是非Pgp介导产生的, 这种Mr 190 000的膜蛋白由MRP编码完成. Filipits et al [10] 认为首先是解决MRP在大肠的表达, 从而解决MRP耐药机制, 克服大肠癌化疗中, MRP具有重要参考价值. 其次评估MRP作为其他临床参数, 包括患者的存活率.Versantvoort et al [11]认为 MRP引起MDR有两种模式. (1)MRP具有运转谷胱甘肽-S-偶合物和细胞毒性药物的双重作用, 药物运转的调节与谷胱肽-S-偶合物运转的调节是密切相关的.(2)MRP是一种谷胱甘肽-S-偶合物运载体, 能够活化内源性潜在药物的运转蛋白, 细胞毒性药物由细胞内的潜在药物转运蛋白转运, 而MRP能与之形成膜相关复合物, MRP对谷胱甘肽-S-偶合物的运转将同样引起药物的一系列变化. 总之MRP在某些实体瘤中已被证实作为另一种MRP基因可能参与替代MDR机制[12].

2 耐药细胞株的现况

自1988年Broggini et al [13]建立结肠癌耐药细胞株以来, 国内外一系列耐药细胞株相继建立. 1989年Sommers et al [14]乳腺癌耐药细胞株建立, K562/A02[15]、SGC7901/VCR、SGC7901/ADM、SGC7901/5-FU、SGC7901/MTX[16]等耐药细胞株相继建立, 为研究MDR机制和MDR逆转, 提高肿瘤细胞对化疗药物敏感性, 从而为临床肿瘤的治疗提供了逆转耐药模型, 以指导临床医生选择合理的化疗方案. 耐药细胞株的建立是选用接种8 h后处于对数生长期的亲代细胞, 用一定的化疗药物浓度反复处理, 待亲代细胞生长稳定后逐步增加药物浓度. 开始2-3 wk增加一倍的剂量药物浓度, 用有限稀释法克隆, 长出克隆后再取出培养, 6-10 mo后[17,18]建立耐药细胞株. 但不同的药物浓度作用于不同的细胞系, 以及不同药物作用方式下所产生的耐药性特征具有明显的差异.Yang et al [17]应用2种方法诱导人结肠癌多药耐药细胞株Adr1.2和SRA1.2, 是由人结肠癌细胞系Lovo培养建株, Adr1.2是由不同浓度的阿霉素长期连续处理诱导建株, SRA1.2是由阿霉素间断处理而诱导建株, 这两个耐药细胞株具有交叉耐药和相似光谱细胞性因素, 但Adr1.2在9种化疗药物实验中, 阿霉素耐药性最强, SRA1.2对长春新硷耐药性最强, 尽管SRA1.2具有Lovo细胞相似的生物学特性, 而Adr1.2可以显著改变其生物学特性.另外, SRA1.2在无药条件下可以维持10 mo耐药性, 进一步研究表明, Adr1.2和SRA1.2作为2种不同的耐药模型, 为研究人结肠癌MDR提供了一种理想模型. Cohen et al [19]所建立HT-29/ADM耐药细胞株, 在这个体系中, 治疗前亚毒性剂量ADM作用于人结肠癌HT-29细胞, 并在无药培养基中培养24 h, 然后用ADM 0.3 mg/mL作用于HT-29细胞1 h, 在这段时间细胞的存活能力和没有治疗的肿瘤细胞相比, 治疗前细胞存活能力增加100倍, 增加ADM剂量(2-8 mg/mL)后, 增加细胞的存活率, 这种结果表明, 具有一小部分抗ADM细胞产生抗ADM表型. 类似的诱导耐药性观察到75%亚克隆细胞是从有限稀释HT-29细胞中分离出来, 提示亲代细胞HT-29可以产生ADM表型, 说明耐药机制的复杂性. 总之, 耐药细胞株的建立为寻求逆转人类肿瘤耐药新型化疗的增敏剂或综合化疗提供了实验模型.

3 MDR的临床意义

MDR产生的主要原因是过度表达的Pgp使大肠癌细胞内药物外流增加, 故任何降低其外流的物质可使细胞内药物聚集增加, 从而有效杀伤大肠癌细胞[20]. 应用灵敏的试验方法, Vitols 发现大肠癌RNA表达水平低于正常组织, 其他显示肾脏附近组织和肾脏具有较高的MDR1mRNA表达水平, 而在肺脏、肝脏、空肠和结肠是中间表达水平, 其他组织是低表达水平[21-25]. 在肾脏附近、肾脏、肝脏和结肠肿瘤中有较高标准的MDR1mRNA[26], MDR1基因过度表达是产生MDR的主要原因.Walther et al [27]研究发现TNF和IL-2可以调节MDR1表达和增加某一MDR1药物在肿瘤细胞系毒性.

MDR临床价值, 决定大肠癌的患者MRP的临床价值, Filipits et al [10]应用RT/PCR及免疫组化的方法研究了MRP表达、MRP表现型, 观察了88%大肠癌标本, 单克隆抗体QCRL-1和QCRL-3在所有标本中占23%强阳性, 77%弱阳性, 对于年龄及性别无明显差别. 早期结肠癌中瘤体大小、级别及远处淋巴结转移, 强阳性的MRP表达与MDR1RNA或Pgp蛋白无关, 与临床大肠癌存活率有明显的差异. 辩认MDR生物学机制可以改善临床大肠癌治疗[28] , 美国癌症防治研究所应用60株细胞株作为新的因子, 以PCR技术设计MDR1/Pgp的表达, 在39株细胞中检出MDR表达基准, 尤其在肾癌和结肠癌有很高表达水平. 一般来说, 由Pgp含量较高的组织发生肿瘤, 其MDR1/Pgp表达水平也较高, 而未经治疗的肺癌、乳癌、食管磷癌等Pgp表达阴性, 说明由MDR1过度表达组织癌变时, 其MDR1基因也表达[29-32] .在大肠癌的治疗过程中, MDR给临床化疗带来许多困难, 国内外学者对MDR作了大量的研究工作, 近年来, 由于使用了更有效的化疗药物, 同时制订了更完备的联合化疗方案, 使大肠癌患者化疗的疗效得到了稳定的提高, 在临床很多患者经过最初的化疗后, 最终产生MDR, 从而使临床化疗失败, 但如何解决MDR方面的诸多问题, 还处于探索阶段.

MDR是耐药的重要形式, 大肠癌的MDR是一种复杂现象, 可能包括MRP基因和MDR1基因, MDR是大肠癌化疗失败的主要原因, MDR的表达水平与大肠癌细胞对化疗药物的耐受性相关, 所以, 通过对MDR的发生机制的研究, 以反映大肠癌患者对药物敏感程度, 以指导临床医生选择合理的化疗方案. MDR作为一种Pgp过度表达, 是临床医生在大肠癌的化疗遇到的技术难关.

4 建立耐药细胞株注意问题
4.1 材料准备

目前, 临床建立许多种耐药细胞株, 选择亲代细胞和药物应与临床应用具有相关性, 试剂和溶液配制严格科学性和严密性.

4.2 建株方法选择

耐药细胞株建立一般分2种方法[17], 一是逐步增加药物浓度的方法作用于亲代细胞, 培养建株; 二是间断大剂量浓度药物作用于亲代细胞建株. 无论是持续或间断诱导都应以与临床周期性化疗相配套, 所建立的耐药细胞株更好模拟化疗后患者出现耐药情况, 更适合研究MDR模型.

4.3 结果判定

临床建立耐药细胞株[13-19], 采用细胞形态学、超微结构观察、细胞生长曲线测定、IC50 (the 50% inhibition concentration)测定、染色体核型分析法等, Yang et al [17]应用基因扩增仪测定所建立的耐药细胞系MDR1, 从分子水平上探讨MDR机制, 从而为临床MDR逆转及化疗增敏剂应用提供更加理想的实验基础.

总之, 耐药细胞株的建立, 为临床研究MDR机制提供良好模型, 为耐药逆转剂研究提供了一定的途径, 但如何把耐药细胞株建立更好与临床肿瘤化疗产生的MDR有机结合起来, 探讨其MDR机制还有待于进一步完善. 对耐药细胞株的各项检测方法有待于进一步研究.大量的体外耐药细胞株建立, 为进行有效的临床化疗耐药机制试验作了准备. 各种耐药逆转剂发现, 可以提高肿瘤细胞内药物浓度, 但无论是何种耐药逆转剂, 对肿瘤细胞内药物浓度只是部分逆转, 提示我们有必要筛选更有效的逆转药物. 随着高效逆转剂的不断发现, 并逐步应用于临床, 各种耐药细胞株的建立, 肿瘤化疗的耐药性将被克服.

1.  Furukawa T, Cuelife JS, Spartt WJ. A clinical pilot study combining surgary with intraoperative pelvic hypsther-mochemotherapy to prevant the colon recurrence of rectal carcer. Anticancer Res. 1993;13:287-291.  [PubMed]  [DOI]
2.  Mori M, Mimori K, Ueo H, Karimine N, Barnard GF, Sugimachi K, Akigoshi T. Molecular detection of circulating solid carcinoma cell in the peripheral blood: the concept of early systemilc disease. Int J Cancer. 1996;68:739-743.  [PubMed]  [DOI]
3.  卿 三华, 周 锡庚, 周 正端, 齐 德林, 姚 明, 梁 立德. 大剂量大容积5－氟尿嘧啶腹腔化疗治疗结直肠癌的实验和临床研究. 中华肿瘤杂志. 1996;18:92-95.  [PubMed]  [DOI]
4.  Almquist KC, Loe DW, Hipfner DR, Mackie JE, Cole SP, Deeley RG. Characterization of the Mr 190 000 multidrug resistance protein (MRP) in drug- selected and transfected human tumor cell. Cancer Res. 1995;55:102-110.  [PubMed]  [DOI]
5.  Peters PJ, Geuze HJ, van der Donk HA, Borst J. A new model for lethal hit delivery by cytotoxic T lymphocytes. Immunol Today. 1990;11:28-32.  [PubMed]  [DOI]
6.  Gewirtz DA. Does bulk damage to DNA explain the cytostatic and cytotoxic effects of Topoisomerase II inhibition? Biochem Pharmacol. 1991;42:2253-2258.  [PubMed]  [DOI]
7.  Sela S, Husain SR, Pearson JW, Longo DL, Rahman A. Reversal of multidrug resistance in human colon cancer cells expressing the human MDR1 gene by liposomes in combination with monoclonal antibody or verapamil. J Natl Cancer Inst. 1995;87:123-128.  [PubMed]  [DOI]
8.  Musto P, Melillo L, Lombardi G, Matera R, di Giorgio G, Carotenuto M. High risk of early resistante relapse for leukaemic patients with presence of multidrug resistance associated P-golycoprotein positive cells in complete remission. Br J Haemtol. 1991;22:50-53.  [PubMed]  [DOI]
9.  Weinstein RS, Jakate SM, Dominguez JM, Lebovitz MD, Koucis SK, Koukoulis GK, Kuszak JR, Klusensl F, Grogan TM, Saclarides TJ. Relationship of the expression of the multidrug resistance geneproduct (P-glycoprotein) in human colon carcinoma to local tumor aggreeiveness and lymph node metastasis. Cancer Res. 1991;51:2720-2726.  [PubMed]  [DOI]
10.  Filipits M, Suchomel RW, Dekan G, Stiglbauar W, Haider W, Depisch D, Pirker R. Expression of the multidrug resistance-associated protein gene incolorectal carcinomas. Brit J Cancer. 1997;75:208-213.  [PubMed]  [DOI]
11.  Versantvoort CH, Broxtermun HJ, Bagri T, Scheper RJ, Twentyman PR. Regulation by glutathion of drug transport in multidrug-resistant human lung tumous cell lines overexpressing multidrug resistance-associated protein. Br J Cancer. 1995;72:82-89.  [PubMed]  [DOI]
12.  Chuman Y, Sumizawa T, Takebayashi Y, Niwa K, Yamada K, Haraguchi M, Furukawa T, Akiyama S, Aikou T. Expression of the multidrug-resistance-assciated protein (MRP) gene in human colorectal, gastric and non-small-cell lung carcinomas. Int J Cancer. 1996;66:274-279.  [PubMed]  [DOI]
13.  Broggini M, Grand M, Ubezio P, Geroni C, Giuliani FC, D Incalci M. Intracellulae doxorubicn concentrations and drug-induced DAN damage in a human colon adenocarcinoma cell line and in a drug-resistant subline. Biochem Pharmacol. 1988;37:4423-4431.  [PubMed]  [DOI]
14.  Sommers CL, Walker-Jones D, Heckford SE, Worland P, Valverius E, Clark R, McCormick F, Stampfer M, Abularach S, Gelmann EP. Vimentin rather than keratin expression in some hormone-independent breast cancer cell lines and in oncogene-transformed mammary epithelial cells. Cancer Res. 1989;49:4258-4263.  [PubMed]  [DOI]
15.  栾 凤君, 杨 纯正, 马 建国, 刘 瑞林, 齐 静. 一株人红细胞多药耐药细胞系(K562/A02)的建立及其耐药特性的研究. 中华肿瘤杂志. 1993;15:101-103.  [PubMed]  [DOI]
16.  蔡 学君, 张 学庸, 樊 代明. 胃癌耐药细胞株耐药谱的体外实验. 第四军医大学学报. 1994;15:86-88.  [PubMed]  [DOI]
17.  Yang LY, Trujillo JM. Biological chracterization of multidrug- resistant human colon carcinoma sublines induced/selected by two methods. Cancer Res. 1990;50:3218-3225.  [PubMed]  [DOI]
18.  Iwahashi T, Okochi E, Ariyoshi K, Watabe H, Amann E, Mori S, Tsuruo T, Ono K. Specific targeting and killing activities of anti-glycoprotein monoclonal antibody MRK16 directed against intrinsically multidrug-resistant human colorectal carcinoma cell lines in the nude mouse model. Cancer Res. 1993;53:5475-5482.  [PubMed]  [DOI]
19.  Cohen AM, Tremiterra S, Candela F, Thaler HT, Sigurdson ER. Prognsis of node positive colon cancer. Cancer. 1991;67:1859-1861.  [PubMed]  [DOI]
20.  敖 朝晖, 卢 圣栋.  现代分子生物学技术. 北京: 高等教育出版社 1993; 408.  [PubMed]  [DOI]
21.  Fojo AT, Ueda K, Slamon DJ, Poplaek DG, Gottesman MM, Pastan I. Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues. Proc Natl Acacl Sci USA. 1987;84:265-269.  [PubMed]  [DOI]
22.  Almquist KC, Loe DW, Hipfer DR, Mackie JE, Cole SP, Deeley RG. Characterization of the Mr 190 000 multidrug resistance protein (MRP) in drug-selected and tramsfected human tumor cell. Cancer Res. 1995;55:102-110.  [PubMed]  [DOI]
23.  Broxterman HJ, Feller N, Kuiper CM, Bover E, Versantvoort CH, Teerlink T, Pinedo HM, Lankelma J. Correlation between functional and molecular analysis of mdr1 P-glycoprotein in human solid-tumor xenografts. Int J Cancer. 1995;61:880-886.  [PubMed]  [DOI]
24.  Chan HS, Grogan TM, DeBoer G, Haddad G, Gallie BL, Ling V. Diagnosis and reversal of multidrug resistance in paediatric cancers. Eur J Cancer. 1996;32A:1051-1056.  [PubMed]  [DOI]
25.  Xie XY, Robb D, Chow S, Hedley DW. Discordant P-glycoprotein antigen expression and transport function in acute myeloid leukemia. Leukemia. 1995;9:1882-1887.  [PubMed]  [DOI]
26.  Goldstein LJ, Galski H, Fojo A, Willingham M, Laisl-Gazdar A, Pirker R, Green A, Crist W, Brodeur GM. Expression of a multidrug resistance gene in human cancers. J Natl Cancer Inst. 1989;81:116-124.  [PubMed]  [DOI]
27.  Walther W, Stein U, Pfell D. Gene transfer of human TNF alpha into glyobla stoma cells peimits modulation of mdr1 expression and potentiation of chemosensitivity. Int J Cancer. 1995;61:832-839.  [PubMed]  [DOI]
28.  Alvarez M, Paull K, Monks A, Hose C, Lee JS, Weinstein J, Graver M, Bates S, Fojo T. Generation of a drug resistance profile byquantitation of mdr1 /p-Glycoprotein in the cell lines of the national cancer institute anticancer drug screen. J Clin Invest. 1995;95:2205-2214.  [PubMed]  [DOI]
29.  Cordon C, Cordon C, O抌occia J. Expression of the multidrug gene product P-Gcycoprotein in human normal and tumor tissues. J Histochem Cyto. 1990;38:1277-1281.  [PubMed]  [DOI]
30.  Germann UA. P-glycoprotein :a mediator of multidrug resistance in tumour cells. Eur J Cancer. 1996;32A:927-944.  [PubMed]  [DOI]
31.  Ford JM. Experimental reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by pharmacological chemosensitisers. Eur J Cancer. 1996;32A:1001.  [PubMed]  [DOI]
32.  Charpin C, Vielh P, Duffaud F, Devictor B, Andrac L, Lavaut MN, Allasia C, Horschowski N, Piana L. Quantitative immunocytochemical assays of P-glycoprotein in breast carcinomas :correlation to messenger RAN expression and to immunohistochemical prognostic indicators. J Natl Cancer Inst. 1994;86:1539-1545.  [PubMed]  [DOI]