抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎

摘要

目的

研究抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎(UC)的疗效和机制.

方法

常规应用激素和/或柳氮磺吡啶(SASP)治疗1 mo以上无效或恶化的UC患者18例 (男8例, 女10例, 平均年龄32.4岁), 加用抗栓灵含片, 2片(相当于2 400 U低分子肝素钠)含化, 2次/d, 观察大便次数、便血情况、自觉症状、肠黏膜肠镜下和组织病理学改变, 并在治疗前和治疗后4 wk用流式细胞仪测定血液中黏附分子P选择素(CD62p), 溶酶体膜糖蛋白(CD63), 血液和组织中细胞间黏附分子(CD54), 多药耐药基因(MDR)产物P-糖蛋白170(Pgp-170), 用放射免疫法测定血栓素A2代谢产物TXB2含量, 用血小板黏附仪测定血小板黏附率.

结果

应用抗栓灵含片治疗后, 与治疗前相比, 大便次数(1.6 vs 8.2次/d)、便血情况(范围0-3, 0.3 vs 2.7分)、肠镜下情况(范围0-3, 1.1 vs 2.6分)、病理组织学观察(范围0-15, 5.0 vs 12.0分)、自觉症状(范围0-5, 0.7 vs 3.9分)均明显改善或缓解(P <0.05). CD62p (4.1±1.8% vs 8.0±3.1%, ), CD63(3.2±1.6% vs 6.3±2.1% ), TXA2(390±67 ng/L vs 548±85 ng/L), 血小板黏附率(34.8±8.1% vs 43.2±10.7% ), 体外血栓形成长度 (1.8±0.3 cm vs 2.3±0.6 cm), 血液中CD54 (14.4±5.1% vs 26.9±6.9% ), 组织中CD54 (23.1±4.1% vs 51.1±6.2%), 血液中多药抗性基因(MDR)产物P-糖蛋白170 (Pgp-170) (10.4±2.7% vs 18.9±3.9%), 组织中Pgp-170 (10.2±2.3% vs 16.5±3.2%)明显下降(P<0.01或0.05).

结论

抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎有效, 可抑制血小板活化和高凝状态, 减轻炎症, 抑制多药耐药基因表达.

关键词: N/A

Treatment of refractory ulcerative colitis with Kangshuangling

Xue-Liang Jiang, Qi-Zhen Quan, Zi-Qin Sun, Yao-Jun Wang, Rui-Lian Shang, Feng Qi

Xue-Liang Jiang, Qi-Zhen Quan, Zi-Qin Sun, Yao-Jun Wang, Rui-Lian Shang, Feng Qi, Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital of Jinan Command Area, Jinan 250031, Shandong Province, China

Supported by: Youth Research Foundation of the Bureau of Health of Shandong Province, No. 2001CA2EFB2.

Correspondence to: Dr. Xue-Liang Jiang, Department of Gastroenterology, Chinese PLA General Hospital of Jinan Command Area, 25 Shifanlu, Jinan 250031, Shandong Province, China. chfjxl@jn-public.sd.cninfo.net

Received: April 15, 2003
Revised: May 20, 2003
Accepted: June 2, 2003
Published online: August 15, 2003

Abstract

AIM

To study the therapeutic effects and mechanism of Kangshuanling in patients with refractory ulcerative colitis(UC).

METHODS

Eighteen patients (8 males, 10 females) with refractory UC unresponsive to high-dose prednisolone and sulfasalazine therapy for more than one month were treated with Kangshuanling (7 200 U/d). Prednisolone was gradually stopped and sulfasalazine maintained. Stool frequency, rectal bleeding, colonoscopy and histology, as well as general well-being were observed and CD62p, CD63, CD54, Pgp-170 (flow cytometry), TXA2 (RIA), blood platelet aggregation rate and thrombosis length in vitro were assessed.

RESULTS

After more than 4 weeks of combined Kangshuanling and sulfasalazine therapy, sixteen patients achieved clinical remission, with a highly significant statistical difference (P<0.01) between pre-and post-treatment mean scores for all disease parameters: stool frequency (8.2/d vs 1.6/d), rectal bleeding (2.7 vs 0.3), colonoscopy (2.6 vs 1.1), histology (12.0 vs 5.0), general well being (4.0 vs 0.6). And CD62p (8.0±3.1% vs 4.1±1.8%), CD63 (6.3±2.1% vs 3.2±1.6%), TXA2 (548±85 ng/L vs 390±67 ng/L), platelet aggregation rate (43.2±10.7% vs 34.8±8.1%), thrombosis length in vitro (2.3±0.6 cm vs 1.8±0.3 cm), CD54 in blood (26.9±6.9% vs 14.4±5.1%), CD54 in tissues (51.1±6.2% vs 23.1±4.1%), Pgp -170 in blood (10.4±2.7% vs 18.9±3.9%), Pgp -170 in tissues (10.2±2.3% vs 16.5±3.2%) decreased significantly (P<0.01 or 0.05).

CONCLUSION

Kangshuanling may be effective in treating refractory UC, the mechanism is partly related to inhibition of platelet activation, hypercoagulative state, MDR expression and anti-inflammatory effects.

Key Words: N/A

0 引言

溃疡性结肠炎(UC)病因和发病机制尚不完全清楚, 应用激素和柳氮磺吡啶(SASP)进行非特异性抗炎治疗可使许多患者得到缓解, 但对激素治疗无效甚至恶化的部分顽固性复发性或重症患者目前还没有理想的治疗方法[1]. 由于这些患者存在高凝状态[2-4], 有学者应用抗凝药物肝素治疗, 取得了一定疗效[5-7], 但普通肝素半衰期短, 注射给药很不方便, 限制了其临床应用.我们应用低分子肝素口服制剂[8,9]治疗激素抵抗型UC取得了较好效果[10], 克服了普通肝素的缺点, 除具有抗凝抗血栓作用外, 还有一定的抗炎作用[11,12], 但口服制剂常无法避免肝脏首过效应, 为此, 我们应用抗栓灵含片(低分子量肝素钠)治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎, 观察其临床疗效并探讨作用机制[13].

1 材料和方法

1.1 材料

常规应用激素和/或柳氮磺吡啶(SASP)治疗1 mo以上无效或恶化的UC患者18例, 男8例, 女10例, 平均年龄32.4岁, 均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制订的溃疡性结肠炎诊断标准[14]. 其中重度10例, 中度8例, 病程7 mo-10 a, 平均4.3 a, 临床表现为便血、腹泻、黏液脓血便及腹痛症状. 3例患者伴有相关的血栓性疾病. 舌下含服抗栓灵含片(低分子肝素钠, 山东淄博松龄制药厂生产, 鲁卫药准字1996-072523) 2片(相当于低分子肝素钠2 400 U), 3次/d, 15d后改为1片/次, 继续同时维持SASA现用量, 逐渐减少激素用量. 正常人对照组20例, 平均年龄30.6岁, 均为健康查体者.

1.2 方法

1.2.1 临床指数评价[7] 分别在治疗前和治疗后对下列临床指数进行量化, 以评价治疗效果: (1)大便次数(过去1wk每天的大便次数); (2)便血(0分: 无; 1分: 偶尔有少许血便; 2分: 经常有明显的血便; 3分: 全部为血便); (3)肠镜下表现根据改良的Baron评分标准分为0分: 正常黏膜图像; 1分: 轻度病变(血管纹理模糊, 黏膜充血但无出血); 2分: 中度病变(黏膜呈颗粒样变化); 3分: 重度病变(黏膜溃疡并自发性出血); (4)组织学分级: 将UC的5项组织学特征(炎性细胞浸润, 隐窝炎, 隐窝脓肿形成, 杯状细胞不成熟, 黏膜上皮增生)每项分为4级(0分: 无; 1分: 轻度; 2分: 中度; 3分: 重度), 总分小于5分为轻度病变, 5-10分为中度病变, 10-15分为重度病变; (5)全身健康(0 = 很好, 1 = 好, 2 = 较差, 3 = 差, 4 = 很差, 5 = 极差).

1.2.2 血小板活化的检测[2,4] 血小板活化的膜标志物可溶性黏附分子P选择素(CD62p)及GP53 (CD63)采用流式细胞仪(FACScan型, 美国Becton Dickinson)测定. 主要试剂: 异硫氰酸荧光素(FITC), 标记的鼠抗人P选择素(CD62p-FITC), 鼠抗人GP53 (CD63-FITC), 同种荧光素标记的阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC, 均为法国Immunotech产品. 取静脉血2 mL, 20 g/L EDTA抗凝, 1 500 r/min离心5 min, 取上清液, 以80 g/L多聚甲醛室温固定15 min, 用PBS漂洗3次, 2 000 r/min, 离心5 min, 调整血小板浓度为300×10⁹/L, 将20 μL CD62p-FITC, CD63-FITC及IgG1-FITC分别加入上述富含血小板血浆100 μL中, 混匀室温避光30 min, 用PBS洗一遍, 弃上清, 上机. 上机前先以标准微球调整仪器, 使变异系数在2%以内, 上机后收集20 000-50 000个细胞, 荧光强度以对数放大, 光散射数据存软盘, 结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析, 以阳性细胞百分数表示. TXA2稳定的代谢产物TXB2 (药盒由苏州医学院提供)采用放免法测定, 按操作说明进行. 血小板黏附率(PAR)采用XSNRⅡ血栓形成、血小板黏附两用仪(无锡电子仪器二厂)测定.

1.2.3 血液和组织中CD54[15], Pgp-170[16,17] 检测 试剂来源: 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人CD54 (CD54-FITC), Pgp-170 (Pgp-170-FITC), 同种荧光素标记的阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC均由法国国际免疫公司生产; 淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产. 血液样本Pgp-170, CD54的制备: 分别取肝素抗凝血2 mL, 重层于淋巴细胞分离液上, 1500 r/min, 离心15 min, 提取其中淋巴细胞层, 再以PBS 3 mL洗2次, 弃上清后用700 mL/L乙醇固定, 4 °C备用. 将制备的细胞悬液分3管, 每管100 μL, 一管加入20 μL Pgp-170-FITC单抗溶液, 一管加入20 μL CD54-FITC, 另一管为阴性对照, 加20 μL羊抗鼠IgG1-FITC, 室温避光反应5 min, PBS洗1次, 弃上清液, 以除去未结合的抗荧光抗体. 组织样品处理: UC患者肠镜检查时用活检钳取结肠溃疡边缘新鲜组织约0.2 g, 正常人在乙状结肠处取新鲜组织约0.2 g, 置于重叠的100目铜网及260目尼龙网上, 用眼科剪剪成1×1×1 mm 碎块, 然后用眼科剪轻搓, 边搓边用磷酸缓冲液(PBS)冲洗入小烧瓶中, 直至组织搓净. 1500 r/min离心5 min, 再用PBS洗2次, 1000 r/min, 离心2 min, 重层于淋巴细胞分离液上, 再以PBS 3 mL洗2次, 弃上清后用700 mL/L乙醇固定, 4 °C备用. 免疫反应: 反应前调整细胞数至10¹²/L, 分取100 μL放入3支试管内, 试管内分别加20 μL CD54-FITC, Pgp-170-FITC和 IgG1-FITC, 室温避光反应30 min, 上机. 流式细胞检测: 流式细胞仪为FACScan型, 美国Becton Dickinson生产. 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内, 上机后收集10 000个细胞, 荧光强度以对数放大, 测定光散射数据, 结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析, 以阳性细胞百分数表示.

统计学处理 采用两样本均数的t检验和等级资料的Ridit分析.

2 结果

2.1 临床疗效

UC患者16例在加用抗栓灵含片治疗后获得临床缓解, 大便次数正常, 2例患者仅表现为便血减少, 症状显著改善的平均时间为3 (1-5) wk, 临床缓解的平均时间为6 (1-12) wk, 4例患者便血在1-2 wk停止, 其余患者2-6 wk停止(表1).

表1 抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性UC的临床疗效.

分组	大便次数	便血(分)	内镜下表现(分)	组织学(分)	全身症状(分)
治疗前	8.2	2.7	2.6	12.0	3.9
治疗后	1.6b	0.3b	1.1b	5.0b	0.7b

^bP<0.01 vs 治疗前.

2.2 CD62P , CD63, TXA2 , PAR和体外血栓长度(TL)变化

与正常人(图1)相比, 难治性UC患者血小板活化的膜标志物P选择素(图2), GP53, 血小板活化的衍生物TXB2及血小板活化后聚集反应血小板黏附率均明显升高(P<0.01, 表2), 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05, 表2), 但CD62p, CD63仍明显高于正常人(P<0.05, 表2).

图1 正常人外周血CD62P含量.

表2 抗栓灵含片对CD62P, CD63, TXA2 , PAR和体外血栓长度 (TL) (mean±SD)影响.

分组	CD62P (%)	CD63 (%)	TXA2 (ng/L)	PAR (%)	TL (cm)
UC治疗前	8.0±3.1b	6.3±2.1b	548±85b	43.2±10.1b	2.3±0.6b
UC治疗后	4.1±1.8ad	3.2±1.6ad	390±67d	34.8±8.1d	1.8±0.3d
正常人	1.9±0.4	1.6±0.8	340±40	34.1±9.1	1.7±0.4

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 正常人;

^dP<0.01 vs 治疗前.

图2 活动期UC患者外周血CD62P含量明显升高.

2.3 血液和组织中CD54, MDR产物Pgp-170变化

与正常人(图3)相比, 难治性UC患者血液中CD54明显升高, 尤以组织中升高更为明显(图4, 表3), 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05, 表3), 但仍明显高于正常人(P<0.05). 与正常人(图5)相比, 血液中MDR产物Pgp-170明显升高(图6, 表3), 血液和组织中无显著性差异, 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P <0.05, 表3), 但仍明显高于正常人(P <0.05).

表3 抗栓灵含片对血液和组织中CD54, Pgp-170 (mean±SD, %)影响.

组别	血液中CD54	组织中 CD54	血液中Pgp-170	组织中 Pgp-170
UC 患者
治疗前	26.9±6.9b	51.1±6.2b	18.9±3.9b	16.5±3.2b
治疗后	14.4±5.1ad	23.1±4.1ad	10.4±2.7ac	10.2±2.3ac
正常人	6.2±3.7	8.8±3.2	6.2±2.2	6.8±3.1

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 正常人;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 治疗前.

图3 正常人组织中CD54含量.

图4 活动期UC组织中CD54含量明显升高.

图5 正常人血液中MDR含量.

图6 激素治疗无效的UC患者血液中MDR明显升高.

3 讨论

抗栓灵含片是以低分子量肝素类物质(Mr 5000-15000, 峰值5000-8000)为主要成分的舌下含服制剂, 为白色或类白色, 每片相当于1 200 IU的低分子肝素钠, 所含肝素经特殊加工, Mr小, 舌下黏膜吸收, 既避免了口服制剂的首过效应[10], 生物利用度高, 又避免了注射给药的不便, 出血副作用少. 肝素除具有抗凝、抗血栓、抗过敏、抗内毒素血症和免疫活性外, 还有较强的抗炎作用[18], 低分子肝素含有大量8-16单糖单位的糖链, 具有抗血栓作用强, 出血倾向小, 安全性高, 半衰期长和生物利用度高等优点[8,9]. 肝素类药物治疗顽固性UC有肯定疗效的报道[10]启发我们应用抗栓灵含片是否更为方便和有效, 结果显示, 18例伴血小板活化的顽固性UC 患者有16例获得临床缓解, 症状消失.同传统的观点认为应用肝素类药物有可能加重出血倾向相反, 应用抗栓灵含片治疗后, 便血消失往往是治疗有效的最早反应, 这同其他应用肝素类药物治疗的结果类似.

研究抗栓灵含片的作用机制可能对阐明UC的部分发病机制具有一定作用. UC患者易合并血栓形成[19], 发生率可高达45.2%, 并认为这与UC患者伴发高凝状态有关. 由于血小板不仅参与止血和血栓形成, 而且是一种炎症递质, 其在UC发病机制中的作用开始引起人们的重视[3,4]. P 选择素属黏附分子选择素家族的组分之一, 由活化血小板和内皮细胞分泌表达, 并可作为这些细胞活化的标志, 介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的黏附. CD63抗原为53 ku的溶酶体膜粘蛋白, 在血小板激活跨位于浆膜, 主要见于单核细胞和巨噬细胞, 可用于活化血小板的检测.我们发现, 难治性UC患者P选择素及GP53较正常人明显升高, 表明血小板处于高活化状态[3,4], 其可能机制: (1)肠系膜血管系统内皮细胞损伤暴露于血小板极敏感的基底膜胶原, 并激发血小板活化. 炎症性肠病患者血清中vonWillebrand因子(内皮细胞损伤的一种标志)增多与这一可能性相符; (2)内毒素和其他吸收的细菌产物激活的单核细胞和中性粒细胞也可激活血小板; (3)血小板和活化的中性粒细胞在肠道病变部位将TXA2和PAF释放至肠系膜循环, 可加速和促进血小板活化, 本研究中TXA2明显升高与这一可能性相符. 血小板活化在UC发病机制中可能的作用: (1)活化的血小板通过局部释放炎症递质, 化学趋化物(如PF4, PAF)及激活其他炎症细胞参与和增强肠黏膜炎症过程. P选择素在中性粒细胞黏附分子中起关键作用, 血小板表达此种抗原使中性粒细胞更易在炎症部位聚集; (2)血小板活化及其衍生的TXA2易使血小板聚集阻塞肠黏膜微循环, 加重肠黏膜缺氧和损伤, 本研究也证实血小板黏附率升高. 另外, TXA2通过引发局部血管收缩可加重缺血; (3)血小板衍生因子(成纤维细胞和单核细胞的化学诱导剂)从活化的血小板释放出来, 在组织损伤后的修复机制中起重要作用[3,4]. 我们还发现, 应用抗栓灵含片治疗后, 难治性UC患者P 选择素、GP53、TXB2及血小板黏附率较活动期有所下降, 说明抗栓灵含片可抑制血小板活化, 改善高凝状态, 从而减轻临床症状, 但P选择素、GP53仍明显高于正常人, 提示部分难治性UC患者仍存在血小板激活状态, 是否对疾病复发或预后有预测意义尚待进一步探讨.

CD54抗原也称细胞间黏附分子-1(ICAM-1), 表达于内皮细胞、上皮细胞, 、成纤维细胞、白细胞和多种类型的肿瘤细胞[15]. 1991年Sethetal用免疫印迹方法首次证实人血清中存在可溶性CD54, 并具有以下特征: (1)含有膜表面CD54分子的大部分细胞外功能区; (2)具有与其配体淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)结合的能力; (3)与白细胞表面的LFA-1配体结合能阻止白细胞与组织固有细胞之间的黏附. 我们采用流式细胞免疫学方法检测UC患者循环中可溶性CD54及组织中CD54, 较正常人明显升高, 尤以组织中升高更为明显, 由于CD54主要介导细胞与细胞间的黏附作用, 在组织炎症的产生过程中, 随着浸润的炎症细胞及组织固有细胞的活化, CD54的表达被上调, 高表达的CD54又可进一步促进炎症细胞的浸润, 引起并加重组织损伤, 因此CD54与UC活动和转归有一定关系. 应用抗栓灵含片后, CD54显著下降, 表明难治性UC患者炎症反应明显减轻, 由于这些患者均为长期(>4 wk)应用激素和/或SASP治疗无效, 因此炎症减轻与加用抗栓灵含片有关, 其他学者也报道肝素类药物可抑制UC患者C-反应蛋白、TNF和L选择素, 确切机制还需进一步探讨.

P-糖蛋白是170 ku的多药抗性基因 (MDR)产物(Pgp-170), 被看作具有广谱底物特异性的ATP-依赖性药物排出泵的作用[16,17]. MDR在肠上皮细胞和淋巴细胞均有表达. 我们发现, 与正常人相比, 难治性UC患者血液中Pgp-170明显升高, 由于糖皮质激素是Pgp-170的底物, 药物治疗无效的UC患者与MDR表达有关. 血液和组织中无显著性差异, 提示外周血MDR表达稳定, 不受疾病活动或激素治疗影响, 且与结肠上皮细胞表达呈正相关. 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0 05), 说明抗栓灵含片对多药抗性有一定的抑制作用, 但Pgp-170仍明显高于正常人(P<0 05). 因此MDR在UC患者对激素治疗的反应中可能起重要作用.

总之, 抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性UC有肯定的疗效, 其机制可能与部分抑制血小板活化和高凝状态、减轻炎症、抑制多药耐药基因表达有关.结合我国UC发病特点, 探讨适合不同类型的UC治疗方法, 仍是当前研究的重点和难点[20].

备注

$[Footnotes]

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