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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 975-978
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.975
复方红景天干预肝纤维化大鼠胶原代谢
曾维政, 吴晓玲, 蒋明德, 邓桂英, 陈晓斌, 张勇, 秦建平, 徐辉
曾维政, 蒋明德, 陈晓斌, 张勇, 秦建平, 徐辉, 成都军区总医院消化内科四川省成都市 610083
曾维政, 男, 1961-12-20生, 湖南邵阳人, 汉族. 1990年重庆医科大学硕士研究生毕业, 教授. 主要从事肝病的基础与临床研究.
吴晓玲, 重庆医科大学附一院消化内科重庆市 400016
邓桂英, 成都市第六人民医院内镜室四川省成都市 610051
基金项目: 成都军区"十五"医药科研基金课题, No. 01A009.
通讯作者: 曾维政, 610083, 四川省成都市天回镇, 成都军区总医院消化内科. zengweizheng@163.com
电话: 028-83577558
收稿日期: 2002-10-08
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-10-22
在线出版日期: 2003-07-15

目的

探讨复方红景天对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化大鼠模型胶原代谢的干预作用.

方法

用CCl4皮下注射法诱导SD大鼠肝纤维化模型, 同时给予复方红景天口服, 观察肝组织病理变化、羟脯氨酸(Hyp)含量、Ⅰ型前胶原(α1(Ⅰ))mRNA表达, 及血清HA、CⅣ、PCⅢ、TGFβ1变化情况.

结果

口服复方红景天可改善肝组织病理变化, 减少Hyp含量(657±74 μg/g vs 1 257±98 μg/g, P<0.05)及Ⅰ型前胶原α1(Ⅰ)mRNA表达(85.7% vs 96.7%, P<0.05), 降低血清HA、CⅣ、PCⅢ、TGFβ1的水平(164±46 μg/L, 97±15 μg/L, 289±76 μg/L, 60±20 mg/L vs 265±98 μg/L, 160±30 μg/L, 456±113 μg/L, 89±23 mg/L. P<0.05, P<0.01).

结论

复方红景天可有效保护CCl4诱导的大鼠肝纤维化, 其作用机制可能与抑制肝脏胶原纤维合成、保护肝细胞等有关.

关键词: N/A
引文著录: 曾维政, 吴晓玲, 蒋明德, 邓桂英, 陈晓斌, 张勇, 秦建平, 徐辉. 复方红景天干预肝纤维化大鼠胶原代谢. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 975-978
Protective effects of Rhodiola sachalinesis A Bor on CCl4-induced liver fibrosis in rats
Wei-Zheng Zeng, Xiao-Ling Wu, Ming-De Jiang, Gui-Ying Deng, Xiao-Bin Chen, Yong Zhang, Jian-Ping Qin, Hui Xu
Wei-Zheng Zeng, Ming-De Jiang, Xiao -Bin Chen, Yong Zhang, Jian-Ping Qin, Hui Xu, General Hospital of Chengdu Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
Xiao-Ling Wu, ChongqingUniversityof Medical Science, Chongqing400016 China
Gui-Ying Deng, The Sixth Hospitalof Chengdu, Chengdu610051, Sichuan Province, China
Supported by: Medical Scientific Foundation of ChengduCommand, No. 01A009.
Correspondence to: Prof. Wei-Zheng Zeng, General Hospital of Chengdu Command, Chengdu610083, SichuanProvince, China. zengweizheng@163.com
Received: October 8, 2002
Revised: October 20, 2002
Accepted: October 22, 2002
Published online: July 15, 2003

AIM

To study the protective effects of Rhodiola schalinensis A Bor on CCl4-induced liver fibrosis.

METHODS: Male SD rats were divided into 3 groups: normal(N), Rhodiola sachalinesis A Bor(R) and model(M) group. The M and R group were given 300 ml/L CCl4(3ml/kg, 2 times/week) for 15 weeks and Rhodiola sachalinesis A Bor (0.5g/kg, p.o., daily for 15 weeks) was administered to rats of R group. Histopathological changes were examined. The changes of hepatic content of hydroxyproline and expression of α1(Ⅰ)mRNA were observed.

RESULTS

Rhodiola sachalinesis A Bor decreased the hepatic content of hydroxyproline (657±74 μg/g vs 1 257±98 μg/g, P<0.05) and severity of hepatic fibrosis, improved the liver histopathological changes and inhibited the expression of α1(Ⅰ) mRNA and decreased the level of HA, CⅣ, PCⅢ and TGFβ1 (164±46 μg/L, 97±15 μg/L, 289±76 μg/L, 60±20 mg/L vs 265±98 μg/L, 160±30 μg/L, 456±113 μg/L, 89±23 mg/L. P<0.05, P<0.01).

CONCLUSION

Rhodiola sachalinesis A Bor is effective in protecting against CCl4-induced liver fibrosis in rats, its machenisms appear to be associated with the inhibition of collagen production and protection of hepatic cells.

Key Words: N/A
0 引言

肝纤维化是许多肝脏疾病的中间发展环节[1-5], 最终会发展为肝硬化[6-8], 因而治疗肝纤维化具有极为重要的临床意义. 寻找有效治疗药物是目前肝病领域研究的热点[9-15]. 红景天具有抗肾、肺间质纤维化, 保护心、肝细胞功能等多种作用, 苦参碱抗肝纤维化及抗病毒作用已有许多报道[10-18], 但疗效却有限.本实验研究旨在观察复方红景天对CCl4诱导大鼠肝纤维化模型胶原代谢的影响, 从组织、血清及分子水平探讨复方红景天干预肝纤维化的疗效及其可能机制.

1 材料和方法
1.1 材料

体重150±10 g健康SD大鼠90只(购自华西医科大学实验动物中心), 随机分为3组: 正常对照组10只, 红景天干预组40只, 模型对照组40只, 各组间暴露因素无差别(P>0.05). CCl4(成都联合化工试剂研究所), 复方红景天颗粒(自制红景天苦参水提物: 生药红景天6 g、苦参3 g制成复方红景天颗粒0.5 g), 羟脯氨酸标准品(中国科学院生物物理研究所), RT-PCR引物(上海生工公司).

1.2 方法

用CCl4皮下注射法制备大鼠肝纤维化模型, 即用300 ml/L CCl4石蜡溶液, 以3 ml/kg做皮下注射, 2次/wk, 共15wk. 红景天组在造模的同时给予复方红景天颗粒水溶液0.5 g/kg每日灌胃, CCl4模型组造模同时予生理盐水灌胃, 正常组予等量石蜡油皮下注射和生理盐水灌胃处理. 各组动物在最后一次CCl4注射后48 h处死, 取肝组织和血清标本待检. 肝纤维化指标HA , CⅣ, PCⅢ采用RIA法; 血清TGFβ1水平采用ELISA法. 肝组织标本HE染色和VG胶原染色、Masson三重染色作组织病理学检查, 按如下标准进行肝组织肝纤维化评分: 0, 正常; +1, 胶原纤维向中央静脉周围延伸; +2, 胶原纤维轻微增生、延伸, 未形成纤维间隔; +3, 胶原纤维增生, 形成假小叶; +4, 纤维间隔增厚, 大量假小叶形成. Jamall法测定肝组织Hyp含量, 即取湿肝组织经盐酸水解、氯胺T溶液、欧氏溶液反应, 558 nm测定A值, 计算标准曲线回归方程和样品含量, 以肝组织匀浆液总蛋白含量校正, 以μg/g表示肝组织Hyp含量. 肝组织切片原位RT-PCR法检测α1(Ⅰ)mRNA表达情况, 参考文献[19]进行, 上游引物(5'→3')CAC CCT CAA CAG CCT GAG TC, 下游引物(3'→5')GTT CGG GCT GAT GTA CCA GT, 以生物素标记, BCIP和NBT显色, 显微镜下观察结果, 根据胞质显色颗粒多少分为4级: (-)蓝色颗粒; (+)少量颗粒; (++)中等颗粒; (+++)大量颗粒.

统计学处理 数据以均值±标准差表示, t检验.

2 结果
2.1 肝组织病理学改变(图1-4)
图1
图1 模型组大鼠肝组织HE染色(10×25).
图2
图2 复方红景天组大鼠肝组织HE染色(10×25).
图3
图3 模型组大鼠肝组织VG染色(10×25).
图4
图4 复方红景天组大鼠肝组织VG染色(10×25).

HE染色光镜下可见模型组大鼠肝细胞广泛脂肪变性、坏死, 有炎性细浸润, 以汇管区及中央静脉周围为重, 肝小叶结构破坏, VG胶原染色及Masson胶原染色见胶原纤维明显增生, 汇管区-中央静脉区纤维间隔宽大, 包绕分隔肝小叶, 形成大量大小不等的假小叶, 假小叶形成率为90%. 红景天干预治疗组大鼠可见肝细胞变性、坏死较轻, 汇管区及小叶间有少量纤维组织增生, 部分向小叶内伸展, 形成纤细的纤维间隔, 仅小部分完全包裹假小叶, 假小叶形成率为42.8%, 二者差别非常显著(P<0.01), 经进行肝纤维化积分分析, CCl4模型组大鼠纤维化积分明显增加(3.5±0.7), 而复方红景天干预性治疗可减低模型大鼠肝纤维化积分(2.4±0.7, P<0.05).

2.2 肝组织Hyp含量

Hyp是胶原纤维特有的氨基酸, 其含量能够代表肝脏胶原纤维的量. 经Jamall法检测, CCl4模型组大鼠Hyp含量(1 257±98 μg/g)显著增高, 而复方红景天干预治疗可明显减少肝组织Hyp含量(657±74 μg/g, 与模型组比较P<0.05), 正常对照组仅为223±37 μg/g, 说明复方红景天能抑制肝脏胶原纤维的合成与沉积.

2.3 肝组织前胶原α1(Ⅰ)mRNA表达

多数CCl4模型组大鼠肝组织标本星状细胞内呈现蓝色颗粒, 阳性率达96.7%, 且多为++～+++, 复方红景天组阳性率为85.7%, 多为+～++(图5, 6), 正常对照仅为20%, 显示CCl4皮下注射造模能使大鼠前胶原α1(Ⅰ)mRNA表达明显增加, 用复方红景天预防可使前胶原α1(Ⅰ)mRNA表达明显减少(P<0.05).

图5
图5 模型组大鼠肝组织内前胶原α1(I)mRNA表达(10×40).
图6
图6 复方红景天组大鼠肝组织内前胶原α1(I)mRNA表达(10×40).
2.4 血清HA，CⅣ，PCⅢ，TGFβ1

CCl4模型组大鼠血清PCⅢ, CⅣ, HA, TGFβ1水平与正常对照组、复方红景天干预组比较差异有极显著性意义(P<0.01), 皮下注射CCl4使大鼠血清PCⅢ, CⅣ, HA水平显著升高, 并与肝纤维化积分呈正相关(r分别为+0.78, +0.65, +0.59, +0.63), 口服复方红景天可明显降低其血清水平(P<0.01, 表1).

表1 大鼠血清肝纤维化指标比较.
分组nPCⅢ(μg/L)CⅣ(μg/L)HA(μg /L)TGFβ1(mg/L)
正常组1090±11b36±10b112±46b44±16b
CCl4组30265±98160±30456±11389±23
红景天组35164±46a97±15a289±76a60±20a
bP<0.01,
aP<0.05, vs CCl4组.
3 讨论

目前肝纤维化的治疗研究非常活跃, 很多方面取得令人嘱目的成绩[20-25], 但已有报道的药物无一被正式批准用于临床抗肝纤维化. 近年来中医药防治慢性肝病显示了光明的前景, 部分中药具有较好的抗纤维化效果[26-35]. 红景天的主要成分为红景天甙、酪醇以及多种氨基酸, 在抗缺氧、抗疲劳、抗肾间质纤维化、抗缺血等方面广泛应用; 但用于肝纤维化动物整体防治未见报道.体外研究发现, 红景天能够保护肝细胞、抑制成纤维细胞增生. 我们在前期的实验中观察到红景天甙对体外培养的HSC增生、活化具有抑制作用, 并能降低胶原纤维合成等作用[36], 苦参(sophora flavescens ait)是一味有效的抗肝纤维化药物, 其主要成分为苦参碱、氧化苦参碱、β-谷甾醇、芥子酸十六酯等. 氧化苦参碱对体外培养的大鼠HSC增生及胶原合成有明显抑制作用, 能减轻肝炎症、保护肝功能, 抑制肝内胶原合成; 且具有活血化瘀、抗乙肝病毒、调节免疫、抑制肝细胞凋亡、保护肝细胞等功效, 大量动物实验均证实其具有一定的抗肝纤维化作用. 我们选用红景天为主药, 辅以苦参的复方红景天颗粒(水提物)对CCl4诱导的SD大鼠肝纤维化模型进行干预性治疗, 从组织、血清及分子水平的探讨其对肝组织胶原代谢的影响.结果显示, 15 wk的CCl4注射能较好制备SD大鼠肝纤维化模型, 组织病理学改变与人类酒精性肝硬化类似. 肝组织切片HE染色发现, 所有模型大鼠肝细胞变性坏死明显, 汇管区胶原纤维明显增多, 并有大量炎性细胞浸润, 假小叶形成率达90%, 肝纤维化积分为3.5±0.7, 二者明显高于红景天组的42.8%和2.4±0.7(P<0.05), 提示复方红景天具有良好改善肝组织病理学指标及抑制胶原合成或增加胶原降解的作用, 血清学检测提示复方红景天能明显降低血清肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、HA、TGFβ1的水平, 与模型组相比具有显著性差异(P<0.01). 肝组织内Hyp检测结果显示模型组含量(1 257±98 μg/g)最高, 红景天组次之(657±74 μg/g), 正常对照组最低, 三组间有明显差异(P<0.05), 亦直接提示复方红景天具有明确抗肝纤维化作用. 分子病理学方法原位RT-PCR检测前胶原α1(Ⅰ)mRNA表达情况表明, 红景天干预组前胶原α1(Ⅰ)mRNA阳性率达87.5%, 且多为+～++, 而模型组为96.7%, 阳性强度多为++～+++, 提示复方红景天抗纤维化作用可能与抑制肝组织前胶原基因表达有关.

尽管对红景天在慢性肝病中的治疗作用定论尚早, 但其抗肝纤维化作用已经组织病理学分子病理学及组织Hyp含量分析及血清肝纤维化标志物等方面得到一定论证, 其分子机制可能与保护肝细胞、抑制炎症及直接抑制胶原合成及增加胶原分解等有关, 其临床应用开发价值不容低估, 值得深入细致的研究.

1.  金 博. 细胞外基质与肝脏疾病. 世界华人消化杂志. 2002;10:53-64.  [PubMed]  [DOI]
2.  周 馨, 李 宣海, 李 定国. 库普弗细胞与肝纤维化. 世界华人消化杂志. 2002;10:65-68.  [PubMed]  [DOI]
3.  何 云, 王 建宾, 王 宇明. 慢性肝炎肝纤维化程度诊断方法的进展. 世界华人消化杂志. 2001;9:1305-1309.  [PubMed]  [DOI]
4.  Su GL, Klein RD, Aminlari A, Zhang HY, Steinstraesser L, Alarcont WH, Remick DG, Wang SC. Kupffer cell activation by lipopolysaccharide in rats: role for lipopolysaccharide binding protein and toll-like receptor 4. Hepatology. 2000;31:932-936.  [PubMed]  [DOI]
5.  Ikeda K, Wakahara T, Wang YQ, Kadoya H, Kawada N, Kane da K. In vitro migratory potential of rat quiescent hepatic stellate cells and its augmentation by cell activation. Hepatology. 1999;29:1760-1767.  [PubMed]  [DOI]
6.  陈 文慧, 刘 平, 徐 光福, 陆 雄, 熊 卫国, 李 风华, 刘 成海. 脂质过氧化在二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化形成过程中的作用. 世界华人消化杂志. 2001;9:645-648.  [PubMed]  [DOI]
7.  Du WD, Zhang YE, Zhai WR, Zhou XM. Dynamic changes of type I, III and IV collagen synthesis and distribution of collagen-producing cells in carbon tetrachloride-induced rat liver fibrosis. World J Gastroenterol. 1999;5:397-403.  [PubMed]  [DOI]
8.  Huang ZG, Zhai WR, Zhang YE, Zhang XR. Study of heteroserum-induced rat liver fibrosis model and its mechanism. World J Gastroenterol. 1998;4:206-209.  [PubMed]  [DOI]
9.  张 盈涛, 苌 新明, 李 欣, 李 恒力. 螺内酯对肝纤维化大鼠I/Ⅲ型胶原蛋白表达的影响. 世界华人消化杂志. 2001;9:1120-1124.  [PubMed]  [DOI]
10.  Wang JY, Guo JS, Yang CQ. Expression of exogenous rat collagenase in vitro and in a rat model of liver fibrosis. World J Gastroenterol. 2002;8:901-907.  [PubMed]  [DOI]
11.  Xu JW, Gong J, Chang XM, Luo JY, Dong L, Hao ZM, Jia A, Xu GP. Estrogen reduces CCL4- induced liver fibrosis in rats. World J Gastroenterol. 2002;8:883-887.  [PubMed]  [DOI]
12.  Liu XJ, Yang L, Mao YQ, Wang Q, Huang MH, Wang YP, Wu HB. Effects of the tyrosine protein kinase inhibitor genistein on the proliferation, activation of cultured rat hepatic stellate cells. World J Gastroenterol. 2002;8:739-745.  [PubMed]  [DOI]
13.  Liu P, Hu YY, Liu C, Zhu DY, Xue HM, Xu ZQ, Xu LM, Liu CH, Gu HT, Zhang ZQ. Clinical observation of salvianolic acid B in treatment of liver fibrosis in chronic hepatitis B. World J Gastroenterol. 2002;8:679-685.  [PubMed]  [DOI]
14.  Liu CH, Hu YY, Wang XL, Liu P, Xu LM. Effects of salvianolic acid-A on NIH/3T3 fibroblast proliferation, collagen synthesis and gene expression. World J Gastroenterol. 2000;6:361-364.  [PubMed]  [DOI]
15.  Ding SP, Li JC, Xu J, Mao LG. Study on the mechanism of regulation on the peritoneal lymphatic stomata with Chinese herbal medicine. World J Gastroenterol. 2002;8:188-192.  [PubMed]  [DOI]
16.  伍 严安, 高 春芳, 王 皓, 黄 超, 孔 宪涛. 苦参碱抑制血小板衍生生长因子诱导的小鼠皮肤成纤维细胞增生. 第二军医大学学报. 2000;21:724-726.  [PubMed]  [DOI]
17.  甘 乐文, 王 国俊, 李 玉莉. 氧化苦参碱对大鼠肝纤维化的影响. 第二军医大学学报. 1999;20:445-448.  [PubMed]  [DOI]
18.  李 继强, 李 超群, 曾 民德, 佘 祥奎, 李 国钦, 范 建高, 华 静, 邱 德凯, 萧 树东. 氧化苦参碱治疗慢性丙型病毒性肝炎的初步研究. 中国中西医结合杂志. 1998;18:227-229.  [PubMed]  [DOI]
19.  曾 维政, 蒋 明德, 楮 桂珍, 张 建华, 陈 泰庆, 楚 人俊, 邓 桂英, 张 家碧. 原位聚合酶链技术检测肝细胞癌组织内丙型肝炎病毒核酸及其意义. 中华内科杂志. 1994;33:747-751.  [PubMed]  [DOI]
20.  伍 严安, 高 春芳, 万 伟东, 王 皓, 孔 宪涛. 全反式视黄酸对人1(Ⅰ)前胶原启动子活性的作用. 世界华人消化杂志. 2001;9:47-49.  [PubMed]  [DOI]
21.  王 宇, 高 毅, 俞 金龙, 黄 宇琦, 蒋 晓青. IFN-α对大鼠肝纤维化间质胶原酶基因表达的调控. 世界华人消化杂志. 2001;9:20-23.  [PubMed]  [DOI]
22.  崔 云华, 王 晓玲, 刘 晴, 刘 平. 丹参酸乙的抗氧化作用对大鼠肝星状细胞增生的影响. 世界华人消化杂志. 2002;10:317-319.  [PubMed]  [DOI]
23.  王 福生, 吴 祖泽. 肝纤维化和肝硬变基因治疗的研究现状. 世界华人消化杂志. 2000;8:371-373.  [PubMed]  [DOI]
24.  张 晶, 宗 春华, 李 定国, 周 仁建, 杜 学亮, 周 馨, 徐 芹芳, 陆 汉明. 肝内肾素-血管紧张素-醛固酮系统与大鼠肝纤维化的关系. 世界华人消化杂志. 2002;10:397-400.  [PubMed]  [DOI]
25.  向 德栋, 魏 永利, 李 奇芬. 转化生长因子β1对Ito细胞作用的分子机制. 世界华人消化杂志. 1999;7:980-981.  [PubMed]  [DOI]
26.  姚 希贤, 唐 有为, 姚 冬梅, 修 贺明. 益肝煎剂对实验性肝纤维化大鼠Ⅰ, Ⅲ型胶原蛋白表达的影响. 世界华人消化杂志. 2001;9:263-267.  [PubMed]  [DOI]
27.  杨 晴, 颜 迎春, 高 彦欣. 去纤软肝胶囊抗肝纤维化的实验与临床研究. 世界华人消化杂志. 2001;9:1246-1249.  [PubMed]  [DOI]
28.  刘 玉侃, 沈 薇. 虫草菌丝对大鼠实验性肝纤维化肝细胞增生的影响. 世界华人消化杂志. 2002;10:388-391.  [PubMed]  [DOI]
29.  杜 荔菁, 唐 望先, 但 自力, 张 文英, 李 绍白. 中药肝炎平防治肝纤维化的实验研究. 华人消化杂志. 1998;6:21-22.  [PubMed]  [DOI]
30.  蔡 大勇, 陈 家春, 赵 刚, 叶 根梅, 邴 飞虹, 陈 金星. 紫金胶囊防治大鼠D-氨基半乳糖性肝损伤. 华人消化杂志. 1998;6:23-26.  [PubMed]  [DOI]
31.  王 晓玲, 刘 平, 刘 成海, 刘 成. 拆方扶正化瘀方对肝细胞及肝星状细胞功能的影响. 世界华人消化杂志. 1999;7:663-665.  [PubMed]  [DOI]
32.  赵 东强, 张 晓岚, 姜 慧卿. TNF-与肝星状细胞. 世界华人消化杂志. 2001;9:947-948.  [PubMed]  [DOI]
33.  沈 敏, 邱 德凯, 陈 颖, 熊 伍军. 重组肝细胞再生增强因子丹参及苦参对大鼠纤维细胞的作用. 世界华人消化杂志. 2001;9:1129-1133.  [PubMed]  [DOI]
34.  李 宝刚, 李 继尧, 梁 惠云, 朱 文玉. 牛磺酸对实验性大鼠肝纤维化的预防作用. 北京医科大学学报. 1998;30:335-336.  [PubMed]  [DOI]
35.  陈 岳祥, 李 石, 张 兴荣, 张 忠夏, 孔 宪涛. 牛磺酸对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的抑制. 中华消化杂志. 1999;19:185-187.  [PubMed]  [DOI]
36.  蒋 明德, 甘 新宇, 解 方为, 曾 维政, 吴 晓玲. 红景天苷对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增生及胶原基因表达的影响. 药学学报. 2002;37:841-844.  [PubMed]  [DOI]