修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15
丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3, NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质. NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响. 为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因, 我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.
以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板, 应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段, 以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3. 以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.
构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定, 证实准确无误. 以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染HepG2细胞之后有NS3蛋白的表达, 提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA, 进行DNA芯片技术分析. 在1152个基因表达谱的筛选中, 发现有34个基因表达水平显著上调, 37个基因表达水平显著下调.
HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子. NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响. DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
引文著录: 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 杨倩. 基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 930-934
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003
To understand the target genes up-regulated or down-regulated by NS3 protein, we compared the differentially expressed genes between the hepatoblastoma cell line HepG2 transfected by pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1-NS3, respectively by cDNA microarray technique.
The NS3 coding DNA fragment was amplified with polymerase chain reaction (PCR) technique by using pBRTM3011 containing the full length of HCV-H cDNA as the template. The expressive vector of pcDNA3.1-NS3 was constructed by routine molecular biological methods. The HepG2 cells were transfected by pcDNA3.1(-) and pcDNA3.1-NS3, respectively using lipofectamine. The total RNA was isolated and reverse transcribed. The cDNAs were subjected for microarray screening with 1 152 cDNA probes.
The expressive vector has been constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing analysis. The expression of NS3 protein has been confirmed by Western blot with single chain variable region (scFv) antibody. High quality mRNA and cDNA had been prepared and successful microarray screening had been conducted. From the scanning results, it was found 34 genes were up-regulated and 37 genes were down-regulated by NS3 protein of HCV.
NS3 protein is a transactivator. The expression of NS3 protein affected the expression spectrum of HCV infected hepatocyte. The microarray is an important technique for the study of transactivating effects for viral proteins.
- Citation: Cheng J, Liu Y, Hong Y, Wang JJ, Yang Q. Screening and identification of genes trans-regulated by hepatitis C virus NC3 protein with microarray assay. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(7): 930-934
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i7/930.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i7.930
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒属, 基因组是一种RNA. HCV感染的慢性化比率很高, 甚至可以达到50-80%, 全国血清流行病学调查的结果显示, 普通人群的抗-HCV阳性率为3.2%[1-3]. HCV感染除引起急、慢性病毒性肝炎(CHC, chronic hepatitis C)、肝硬化(liver cirrhosis)、肝细胞癌(HCC, hepatocellular carcinoma)之外, 而且与肝脏脂肪变(steatohepatitis)、糖代谢紊乱有关[4,5]. 因此, HCV感染与乙型肝炎病毒(HBV)感染的致病机制是不同的. HCV基因组中含有唯一一个开放读码框架(ORF, open reading frame), 编码由3000个左右的氨基酸残基(aa)组成的多肽, 然后在病毒的蛋白酶和肝细胞信号肽酶的作用下, 裂解生成10种不同的结构和非结构蛋白[6,7]. 因为HCV的基因复制形式没有经过DNA阶段, 因此就不存在HCV基因组与肝细胞基因组DNA的整合, 所以, HCV感染之后的致病机制, 主要是通过HCV基因组编码的蛋白-肝细胞蛋白之间的相互结合与作用, 肝细胞蛋白与HCV调节基因的结合与作用, 以及HCV基因组编码蛋白对于肝细胞基因表达谱的影响[8-12].
HCV基因组编码的蛋白分子中, 核心(core)蛋白、非结构蛋白3(NS3)和非结构蛋白5A(NS5A)是相当明确的具有反式激活(transactivation)作用的病毒蛋白[13-15]. 关于这些反式激活作用的蛋白所作用的靶基因类型, 利用基因的差异表达技术、微矩阵(microarray)技术等进行了筛选, 获得了大量有价值的结果, 是研究HCV感染对于肝细胞基因表达谱影响的有效技术手段, 我们应用微矩阵技术, 对于HCV NS3蛋白基因转染和空白表达载体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2进行筛选, 试图从HCV NS3蛋白的表达对于肝细胞基因表达谱的影响, 探索HCV感染的发病机制, 包括HCV相关的HCC发生发展的分子生物学机制.
HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS 转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(amersham pharmacia biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×CR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(boehringer mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega).
1.2.1 真核表达载体及细胞转染 HCV NS3蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3由本室构建. 用Lipofectamine PLUS 转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-NS3及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2细胞, 48 h后收获细胞.
1.2.2 细胞mRNA提取 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了NS3表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析.
1.2.3 探针标记 参照Schena et al的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μL 5 SSC+2g/L SDS杂交液中.
1.2.4 芯片制备 包含的1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 μg/μl溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用2 g/L SDS、水及2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.
1.2.5 杂交及洗涤 将基因芯片和杂交探针在95 °C水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 °C杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 2 g/L SDS、0.1×SSC +2 g/L SDS、0.1×SSC洗涤10 min, 室温晾干.
1.2.6 检测与分析 用General Scanning公司的ScanArray 3000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene 3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3＞2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3＜0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.
HCV NS3蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3由本室构建.
总RNA的吸光度A260/A280>1.89, 热稳定实验70 °C保温1 h与-20 °C 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.
在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在2.000以上, 就判断为HCV NS3蛋白得上调基因. 在本研究中发现有34种基因的表达水平上调(表1).
| 编号 | Cy3/Cy5比值 | 基因名称 |
| 1 | 2.010 | FLJ21930 |
| 2 | 2.026 | 水通道蛋白4(AGP4) |
| 3 | 2.042 | 果蝇MAD同源基因2(MADH2) |
| 3 | 2.044 | 组氨N-甲基转移酶(HNMT) |
| 4 | 2.054 | S-腺苷同型半胱氨酸羟化酶(AHCY) |
| 5 | 2.069 | FYN-结合蛋白(FYB-120/130)(FYB) |
| 6 | 2.087 | p53结合蛋白MDM4 |
| 7 | 2.113 | 全长插入cDNA克隆, EUROIMAGE 233360 |
| 8 | 2.113 | 谷胱甘肽过氧化物酶2(GPX3) |
| 9 | 2.135 | 丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶5(MAP3K5) |
| 10 | 2.141 | 黑色素瘤抗原家族A10(MAGEA10) |
| 11 | 2.154 | 钾离子内流通道J3(KCNJ3) |
| 12 | 2.166 | 成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2) |
| 13 | 2.188 | FK506结合蛋白相关蛋白(FAP48) |
| 14 | 2.202 | 硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1) |
| 15 | 2.222 | 组织相容性13同源基因 |
| 16 | 2.250 | 谷氨酸受体M3(GRM3) |
| 17 | 2.274 | 酪蛋白激酶1α(CSNK1A1) |
| 18 | 2.286 | BCL-10 |
| 19 | 2.292 | 肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM-1) |
| 20 | 2.300 | 脆性X精神迟滞蛋白1(FMR1) |
| 21 | 2.332 | XI型胶原α链(COL11A1) |
| 22 | 2.394 | LR蛋白8(LR8) |
| 23 | 2.411 | 类固醇C5去饱和酶(SC5DL) |
| 24 | 2.420 | 淘汰素2(CUL2) |
| 25 | 2.514 | 脚手架黏附因子B(SAFB) |
| 26 | 2.519 | 半乳糖苷转移酶相关蛋白激酶(p58/GTA) |
| 27 | 2.528 | 转化生长因子βII受体α |
| 28 | 2.566 | 接头蛋白相关蛋白复合物1(AP1M2) |
| 29 | 2.596 | 推定蛋白KIAA0942 |
| 30 | 2.706 | 推定蛋白KIAA1641 |
| 31 | 2.728 | 推定蛋白FLJ21819 |
| 32 | 2.776 | 溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2B) |
| 33 | 2.832 | 酵母有丝分裂阻滞缺陷同源基因样基因1(MAD1L1) |
| 34 | 3.147 | 真核细胞翻译延长因子2(EEF2) |
在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCV NS3蛋白的下调基因. 在本研究中发现有37种基因的表达水平下调(表2).
| 编号 | Cy3/Cy5比值 | 基因名称 |
| 1 | 0.296 | HIV-1 Tat作用蛋白2(HTATIP2) |
| 2 | 0.313 | 单链DNA结合蛋白1(SSBP1) |
| 3 | 0.329 | 果蝇增生相关同源基因(MAGOH) |
| 3 | 0.364 | 鸟苷酸环化酶1α3(GUCY1A3) |
| 4 | 0.372 | CGI-99蛋白(LOC51637) |
| 5 | 0.375 | 热休克蛋白105 kD(HSP105B) |
| 6 | 0.377 | 四三肽重复位点2(TTC2) |
| 7 | 0.379 | 酵母RAD23同源基因B(RAD23B) |
| 8 | 0.391 | 核糖核酸酶H1(Rnase H1) |
| 9 | 0.391 | 推定蛋白HSPC111 |
| 10 | 0.400 | 硫基转移酶(GLRX) |
| 11 | 0.402 | 死亡相关蛋白6(DAXX) |
| 12 | 0.425 | 肿瘤蛋白p53结合蛋白(TP53BPL) |
| 13 | 0.429 | ATP合成酶(ATP5G1) |
| 14 | 0.433 | 伴侣蛋白10(HSPE1) |
| 15 | 0.434 | 核孔蛋白153(NUP153) |
| 16 | 0.436 | 前折叠蛋白5(PFDN5) |
| 17 | 0.438 | 蛋白体亚单位α2(PSMA2) |
| 18 | 0.443 | 核糖体蛋白S5(RPS5) |
| 19 | 0.446 | 热休克蛋白8(HSPA8) |
| 20 | 0.452 | 推定蛋白MGC2668 |
| 21 | 0.453 | 小核核蛋白多肽G(SNRPG) |
| 22 | 0.465 | 蛋白体亚单位α3(PSMA3) |
| 23 | 0.466 | 焦磷酸酶(PP) |
| 24 | 0.468 | 微粒体谷胱甘肽S-转移酶3(MGST3) |
| 25 | 0.469 | CD14 |
| 26 | 0.477 | 核糖体蛋白S14(RPS14) |
| 27 | 0.477 | 核糖体蛋白L10a(RPL10A) |
| 28 | 0.482 | 颅面发育蛋白1(CFDP1) |
| 29 | 0.483 | TNF受体相关因子2(TRAF2) |
| 30 | 0.485 | 可溶性载体家族25相似蛋白 |
| 31 | 0.487 | ralA结合蛋白(RALBP1) |
| 32 | 0.488 | 染色体20开放读框1(C20orf1) |
| 33 | 0.492 | 金属硫蛋白1G(MT1G) |
| 34 | 0.497 | 高移动性家族蛋白17(HMG17) |
| 35 | 0.499 | ATP合酶(ATP5G2) |
| 36 | 0.499 | 未成熟结肠癌转录子1(ICT1) |
| 37 | 0.500 | 细胞死亡防卫蛋白1(DAD1) |
丙型肝炎病毒(HCV)基因组编码的非结构蛋白3(NS3)是一种具有多种生物学功能的蛋白质. 除了具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶等之外, 对于HCV基因组表达的结构和非结构蛋白的结构与功能具有重要的调节作用[16-22]. Koch et al[23]研究了NS3蛋白对于NS5A蛋白磷酸化修饰的影响. NS5A是一种高度磷酸化的蛋白, 与干扰素抗性、HCV RNA的复制过程有关. NS5A蛋白的磷酸化是由细胞的蛋白激酶结合成蛋白复合物形式进行的. 对于1b型HCV-J, 除了存在基本形式的磷酸化NS5A蛋白(pp56)之外, 如果与NS4A蛋白一起进行表达时, 还存在着一种超磷酸化形式的NS5A(pp58). 对于NS5A高度磷酸化修饰及缺陷的2株1b型HCV全基因组序列进行比较分析, 发现只有当NS3-5A连续表达时才会发生, 但是分别表达, 再反式提供时就不能发生NS5A蛋白的高度磷酸化. NS3基因区发生点突变, 不影响多蛋白的裂解过程, 但是对于NS5A蛋白的高度磷酸化过程产生影响. 在NS4A蛋白的中部或羧基末端发生小范围的缺失突变, 对于多蛋白的裂解过程没有影响, 但是可以显著降低或阻断NS5A蛋白的磷酸化过程. 这些结果提示NS3-5A多蛋白亚单位之间的正确折叠对于NS5A蛋白的磷酸化过程非常重要.
基因芯片分析技术在HCV感染及其发病机制的研究中具有重要的应用前景. 包括肝炎病毒蛋白的表达对肝细胞基因表达谱的影响、HCV RNA基因分型等. Aizaki et al[24]应用基因芯片技术结合半定量PCR技术, 对于表达HCV全基因或部分基因的细胞系的基因表达谱进行分析. 发现HCV基因的表达可以上调12种基因, 下调4种基因. 表达水平发生改变的基因类型包括细胞生长的调节基因, 如叉头转录因子-1(forkhead transcription factor, FREAC-1)、多聚腺苷酸结合蛋白2(poly A binding protein, PABP2), Ras抑制子-1(ras suppressor, Rsu-1), 以及在T细胞应答过程中具有重要作用的主要组织相容性(MHC)抗原等. 功能基因组学是研究HCV致病机制的重要的工具和方法[25-29]. Iizuka et al [30]对于HBV和HCV相关的HCC组之中的基因表达谱进行了比较分析. 在6000以上靶点分析中, 发现有83个基因的表达水平有显著差别. 其中31个基因在HBV相关的HCC中表达水平升高, 52个基因在HCV相关的HCC中升高. 在31个基因中包括H19和IGF2, 以及与信号转导、转录和转移相关的基因. 52个基因中, 包括一些解毒基因和免疫调节基因. 这些结果表明, HBV和HCV感染引起的HCC, 分子生物学机制不完全相同. 对于HCC发生的分子生物学机制的研究具有十分重要的意义. HCV NS5A蛋白对于HCV感染后抑制干扰素系统的抗病毒作用具有重要意义. 但是对于NS5A抵抗干扰素的抗病毒作用的分子生物学机制目前我们还知之甚少[31-37]. Girard et al[38]应用基因芯片技术, 对于NS5A蛋白表达影响肝癌细胞系(Huh7)基因表达谱的结果进行研究. 受到干扰素的刺激之后, 50种基因的表达水平变化在2倍以上, 41种上调, 9种下调. NS5A表达影响最大的一种基因就是OAS-p69. 表达NS5A的肝癌细胞系Huh7中白介素-8(IL-8)的表达水平显著上调. 向Huh7培养系统中加入IL-8, 就象转染NS5A基因一样, 抑制干扰素诱导的抗病毒活性, 包括下调OAS-p69基因的表达.
HCV感染之后的慢性化以及疾病的进程机制目前还不清楚. 基因芯片技术的出现为阐明HCV感染之后的肝脏基因表达谱的改变提供了最有力的研究工具. Bigger et al[39]应用基因芯片技术, 对于急性感染HCV后清除病毒的黑猩猩进行研究. 在实验感染HCV之后6-8 wk就发生了病毒血症的清除, 但是HCV阳性的肝细胞的清除在HCV感染之后的14 wk才完成. HCV病毒的清除, 主要与干扰素诱导的基因类型的表达有关, 包括所有3种经典的干扰素抗病毒的分子机制途径. 有些基因的表达在HCV感染之后的2 d就已经启动. 基因芯片分析的结果表明, 这种病毒的清除过程具有明显的双阶段机制(biphasic mechanism). Lanford et al[40]应用HCV实验感染的黑猩猩, 对于HCV感染后肝脏基因表达谱的改变进行了研究. 因此, 黑猩猩作为HCV感染的唯一合适的动物模型, 除了在早期阶段研究HCV, 甚至是在克隆HCV基因组时作为重要的模型和材料来源之外, 还是研究HCV感染后致病机制, 探索新型治疗技术和方法的重要的资料来源.
为了阐明肝细胞癌发生的分子生物学机制, 比较肝细胞癌组织与癌周组织之间基因表达谱的差别, Okabe et al [41]对于20份肝细胞癌及其癌周组织, 进行23040靶点的基因芯片技术分析, 在上调的基因中, 主要是促进有丝分裂的基因. HBV阳性和HCV阳性的HCC组之间的基因表达谱有显著差别, 主要是一些酶类、致癌物或抗癌药物代谢相关酶类. 此外还筛选到一些与肿瘤的组织学表型、侵袭性表型有关的基因类型. 这些研究结果对于判断肿瘤的性质、寻找抗肿瘤治疗的新型靶位、肿瘤患者的个体化治疗等都具有十分重要的意义. Huang et al[42]建立了四环素诱导表达非结构蛋白的人肝癌细胞系, 利用6416靶点的基因芯片技术, 对于HCV非结构蛋白表达时反式激活靶基因进行筛选, 获得了满意的结果.
基因芯片技术在HCV感染的基因诊断中具有重要应用前景. Zhao et al[43]应用基因芯片技术对于HCV RNA的基因分型进行了研究. 根据HCV的5'-非翻译区基因序列设计合成探针, 制成玻璃芯片, 对于60份HCV RNA阳性的血清标本进行检测, 同时以60份HCV RNA阴性的血清标本作为对照. 以荧光定量PCR技术对于HCV RNA进行定量. 然后对于HCV RNA基因分型进行基因芯片分析. 60份阳性标本基因芯片检测的HCV RNA都是阳性, 其中46份为1b, 3分为3a, 3份为3b , 2份为2a, 2份为2b, 2份为1b、2a 混合型, 2份为3a型. 基因序列测定结果表明, 50份为1b性, 3份为3a性, 3份为3b性, 2份为2a性, 2份为2b性. 2种方法的检测结果一致率为93.3%. 认为基因芯片技术是HCV RNA基因分型的重要技术途径[44-46].
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