病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 925-929
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.925
乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因10的克隆化研究
成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚
成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
成军, 男, 1963-08-17生, 山东省淄博市人, 汉族. 1986年毕业于第一军医大学军医系, 获医学学士学位, 1989年毕业于军医进修学院, 获传染病学硕士学位, 1994年毕业于北京医科大学, 获传染病学博士学位, 1994-11-17/1997-12-01在美国得克萨斯大学健康科学中心临床免疫与传染病科完成博士后研究, 教授, 主任医师. 现任中华医学会传染病与寄生虫病学分会副主任委员、中华医学会热带病与寄生虫病学分会全国常委、全军医学科学技术委员会传染病与寄生虫病学会委员. 目前从事传染病特别是病毒性肝炎的临床医疗工作和基础研究工作, 学术研究方向是肝炎病毒与肝细胞相互作用的分子生物学机制, 已出版专著5部, 发表论文及综述300篇.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No.C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-6693-3391 传真: 010-6380-1283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15

目的

乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质. 为了探索HBxAg蛋白反式激活作用新的靶基因, 利用基因芯片技术(DNA chips)对于表达和不表达HBxAg的HepG2细胞的基因表达谱进行比较, 以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点, 为阐明HBxAg的反式激活作用分子生物学机制, 以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.

方法

以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板, 根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物, PCR扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 转染肝母细胞瘤细胞系HepG2, 提取RNA并进行逆转录. 进行基因芯片技术分析. 以生物信息学技术, 克隆、鉴定新基因.

结果

在16种HBxAg上调的靶基因中, 其中包括未知功能基因, 利用生物信息学技术, 获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因, 开放读码框架(ORF)长度为1206个核苷酸(nt), 编码产物由401个氨基酸残基(aa)组成, 命名为XTP10.

结论

HBxAg是一种具有反式激活作用的蛋白. 基因芯片技术是进行基因表达谱分析的可靠、有效技术. 分子克隆技术结合生物信息学技术, 是目前鉴定、克隆未知功能新基因的有效技术途径.

关键词: N/A
引文著录: 成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 钟彦伟, 董菁, 王刚. 乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因10的克隆化研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 925-929
Identification and characterization of gene 10 transactivated by hepatitis B virus X protein with DNA microarray assay
Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Lin Wang, Yan-Wei Zhong, Jing Dong, Gang Wang
Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Lin Wang, Yanwei Zhong, Jing Dong, Gang Wang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No.98H038.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhonglu, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: January 11, 2003
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003

AIM

To study the target genes transactivated by HBxAg.

METHODS

Specific primers were designed and synthesized according to the HBV DNA sequence of subtype. Polymerase chain reaction (PCR) was conducted to amplify HBxAg coding sequence by using pCP10 plasmid containing 2 copies of head to tail HBV DNA as the template. The expressive vector of pcDNA3-HBxAg was constructed for the transfection of hepatoblastoma cell line HepG2 by Lipofectamine PLUS reagent. Total RNA was prepared from HepG2 and HepG2 cells transfected by pcDNA-HBxAg vector. The RNA was reversely transcribed for further microarray assay.

RESULTS

From the microarray assay, 16 genes were found to be up-regulated, and 58 genes down-regulated. Among them, one gene named XTP10 without known function with 1 206 nt in length, was up-regulated. The encoded protein consisted of 401 amino acid residues (aa).

CONCLUSION

HBxAg is a potential transactivator. DNA microarray is a liable and efficient method for analysis of differentially expressed genes. Molecular biological methods in combination with bioinformatics pave the way for the discovery of new genes transactivated by HBxAg with unknown functions.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)基因组中最小的开放读码框架(ORF)编码的X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活(transactivation)作用的病毒蛋白, 在HBV感染肝细胞的恶性转化中具有十分重要的作用[1-4]. 关于HBxAg反式激活作用的机制以及在肝细胞癌(HCC, hepatocellular carcinoma)发生发展中的作用, 已经十分明确, 但是, 还有许多方面没有阐明[5-7]. 为了寻找HBxAg反式激活的新的靶基因, 我们应用基因芯片(DNA chips)技术, 对于HBxAg蛋白反式激活作用的靶基因进行筛选, 证实一种未知功能基因是HBxAg反式激活作用的靶基因, 对于其基因序列进行了分析.

1 材料和方法
1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS 转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(amersham pharmacia biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50碈R Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(Boehringer Mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega).

1.2 方法

1.2.1 乙型肝炎病毒X蛋白真核表达载体的构建 以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板, 根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物, 进行PCR扩增. 扩增的HBxAg的编码基因首先克隆到TA载体中进行序列测定, 然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中, 构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBxAg[8].

1.2.2 肝母细胞瘤细胞系HepG2的转染 肝母细胞瘤细胞系HepG2以RPMI1640完全培养基培养, 前1 d传代, 75%融合度的细胞, 应用Lipofectamine PLUS转染试剂进行转染, 真核表达载体质粒DNA用量为1μg. 转染后48 h收获细胞[9-13].

1.2.3 总RNA的提取和逆转录 应用Trizol试剂盒提取转染细胞的总RNA, 并进行逆转录[14].

1.2.4 基因芯片技术分析 按照联合基因公司的基因表达谱芯片产品说明, 进行基因表达谱分析.

2 结果
2.1 乙型肝炎病毒X蛋白真核表达载体的构建及细胞转染

经过限制性内切酶消化作图分析, 以及插入基因片段的核苷酸序列分析, 证实构建的真核表达载体正确[8].

2.2 总RNA的提取和逆转录

获得RNA总量为2.6 μg, 并进行逆转录[8].

2.3 基因芯片技术分析

经过基因芯片技术分析, 证实转染真核表达载体pcDNA3-HBxAg的HepG2细胞与转染空白载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行比较, 发现HBxAg蛋白上调的靶基因有16种, 下调的靶基因有58种.

2.4 新基因的序列分析

在16种HBxAg上调的靶基因中, 其中包括未知功能基因, 利用美国国立卫生院(NIH)国立医学图书馆(NLM)国立生物工程中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)及其同源基因序列的搜索(BLASTN), 获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因(图1), 命名为XTP10. 新基因的开放读码框架(ORF)长度为1206个核苷酸(nt), 编码产物由401个氨基酸残基(aa)组成. 新基因的核苷酸序列在GenBank中登录, 登录号为NM_024824.

图1
图1 HBxAg反式激活靶基因XTP10核苷酸及其编码产物序列.
3 讨论

肝炎病毒的基因组编码一系列具有反式激活作用的病毒蛋白质, 例如HBV基因组编码的羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)、HBxAg, 丙型肝炎病毒(HCV)基因组编码的核心(core)蛋白、非结构蛋白3(NS3)、非结构蛋白5A(NS5A)等都已经证明是具有反式激活作用的病毒蛋白类型[15-19]. 研究反式激活作用蛋白靶基因的技术, 主要是基于差异显示技术原理建立的一些分子生物学技术. 例如, 任意引物差异显示逆转录多聚酶链反应(AP-DD-RT-PCR, arbitrary primer differential display reverse transcription polymerase chain reaction)技术、代表性差异显示技术(RDA, representative differential display)、抑制性消减杂交技术(SSH, suppression subtractive hybridization)等. 随着分子生物学技术、计算机分析技术、自动化技术的结合建立起来的微矩阵(microarray)技术, 对于差异表达基因进行高通量筛选成为可能[20,21]. 这些技术在分析反式激活靶基因的研究中各有利弊. 微矩阵技术具有简便、高通量、可以同时处理大量标本的优点, 但是其筛选的范围主要决定于基因芯片上所点(印刷)核苷酸探针的种类和数量. 人类基因组计划(HGP)的研究之初, 估计人染色体中的表达基因可能在10万个左右, 目前根据染色体的精确作图分析, 以及部分序列测定与分析的结果来看, 人染色体中编码基因的数量可能要少于10万个. 目前对于人染色体中的编码基因还没有完全阐明, 所以目前的基因芯片受到基因类型选择和芯片容量的限制, 只能是对于人染色体编码基因的一小部分进行筛选研究, 而对于另一部分就有遗漏的缺陷. 关于RDA、AP-DD-RT-PCR和SSH等技术, 虽然他们没有微矩阵技术高通量的特点, 但是这些技术对于筛选对象基因没有先决条件, 对于人染色体基因组表达的基因类型是随机性地筛选, 因此可以筛选得到微矩阵技术筛选不到、从来没有进行过研究的基因类型. 因此, 从技术本身来看, 研究基因表达谱的差异, 这些技术都有用武之地, 相互补充[22-29].

关于HBxAg的反式激活作用, 特别是结构与功能之间相互关系既往已经进行了深入的研究和探索. HBxAg蛋白功能域的分析: Guo et al[30]认为至少有一个位于103-117 aa的功能域对其作用非常重要. Madden et al[31]结果显示, N末端和C末端对其反式激活都不重要, 认为转录活性区位于32-148 aa内: 105-148区富含负电荷, 是其他反式激活因子的典型激活功能域所具有的特征; 32-66 aa区可能为结合功能域. Haviv et al[32]认为C末端134-139 aa(LGGCRHK)较保守, 缺失后HBxAg的反式转录活性几乎完全丧失. Bouchard et al[33]认为有3个关键功能域: 第46-52 aa(尤其是Pro-46、His-49、His-52), 第61-69 aa(尤其是Cys-61、Gly-67、Pro-68、Cys-69), 第132-139 aa(尤其是Phe-132、Cys-137、His-139), 这三段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守, 第一段序列形成组氨酸/天冬氨酸功能样特征, 第二与第三段序列与Kunitz样丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz功能区高度同源. N末端5-27 aa或C末端143-154 aa缺失, 对X蛋白活性没有影响. 但也有相互矛盾的结果, 可能是HBxAg蛋白在不同细胞通过不同因子或途径起作用而导致所需的功能域不同所致.慢性HBV感染者, HBxAg蛋白在HCC形成过程中具有十分重要的意义. Ogden et al[34]发现HBxAg的反式激活功能, Vero细胞中表达的HBxAg蛋白能够增强人干扰素β(IFN β)调控序列控制下的氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达. 后来的研究发现HBxAg蛋白可作用于多种基因的增强子和启动子元件, 包括HBV的增强子和C基因的启动子、SV40早期增强子/启动子、多种病毒的长末端重复序列(LTR)、人IFN β基因调控序列, 对c-myc、人白细胞抗原-DR(HLA-DR)、主要组织相容性抗原-I(MHC-I)及白介素-8(IL-8)等都有反式激活作用. 为了研究HBV感染者HBxAg蛋白在肝细胞恶性转化过程中的具体作用, Lee et al[35]构建了受四环素严格调控的HBxAg蛋白表达载体, 建立表达HBxAg蛋白的分化细胞系3pX-1和去分化细胞系4pX-1. 只有3pX-1细胞系有恶性转化的现象, 主要机制就是持续的Ras-Raf-MAPK系统的激活. 没有发生转化的4pX-1细胞系具有持续的JNK信号转导系统的激活. HBxAg蛋白在3pX-1和4pX-1细胞系中参与的信号转导通路是有差别的. 对于这2个细胞系的细胞周期参数进行比较研究, 3pX-1细胞系表现出HBxAg蛋白依赖性的G1、S和G2/M期的进展, 表现为细胞周期素D1、A和B1的表达水平升高, Cdc2激酶的激活等. 在 4pX-1细胞系中可以见到HBxAg蛋白依赖性的G1和S期的进入, 之后是S期的停止, 缺乏Cdc2激酶的激活. 4pX-1细胞系表现出HBxAg蛋白诱导的细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p21(Cip1)、肿瘤抑制蛋白p19(ARF)、细胞凋亡蛋白bax以及胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达. 尽管出现了HBxAg蛋白诱导的生长停滞, 也没有Cdc2的激活, 但4pX-1细胞系并没有出现HBxAg蛋白依赖性G2/M阻滞或细胞凋亡. HBV的HBxAg蛋白可以诱导Fas配体(FasL)的表达, 从而帮助肝细胞癌(HCC)细胞逃避宿主的免疫监视系统.

HBxAg蛋白对于细胞基因表达的影响是十分广泛的, 这也是HBV相关的HCC发生发展的重要机制所在. 但是, 关于HBxAg蛋白的分子生物学作用机制, 大部分都是以肝癌细胞系作为细胞模型进行研究的, Nijhara et al[36]构建了转导正常肝细胞的有效基因转移途径, 结果表明, 这种基因转移技术可以使50%以上的细胞表达HBxAg蛋白. Tarn et al[37]的结果证实HBxAg引起的肝细胞的恶性转化过程与RAS-RAF-MAPK和JNK信号转导到途径有关. Kang-Park et al[38]证实HBxAg蛋白通过转录因子Sp1调节胰岛素样生长因子II(IGF II)启动子4的活性. 在这一调节系统中, PKC和p44/p42MAPK是必须的. 首先, PMA对PKC的激活, 或者PKC的表达载体可以促进Sp1转录因子的磷酸化, 提高P4启动自得转录活性. PKC的抑制剂Go6976可以降低Sp1的磷酸化, 同时降低P4启动子的活性以及IGF-II mRNA的转录表达水平. MEK 激活抑制剂U0126降低Sp1的磷酸化水平, P4启动子活性和IGF-II mRNA转录表达水平下降. 这些结果说明PKC、p44/p42 MAPK信号转导通路是HBxAg 通过Sp1介导的IGF-II基因激活的重要条件. Pflum et al[39]证实, HBxAg与CREB之间可以结合, 并且可以促进这种蛋白的DNA结合能力. HBxAg在反式激活靶基因转录调节的机制中, 需要Ser-133位点没有发生磷酸化修饰的CREB的参与. HBxAg可以上调Camp应答基因的表达, 说明在肝细胞的增生, 直至肝细胞的恶性转化过程中都有十分重要的作用. Park et al[40]应用p53基因发生突变的Hep3B细胞系进行了研究, 以HBxAg表达载体进行稳定转化时, p21(waf1/cip1)mRNA转录和蛋白表达水平显著升高, 与CDK2结合的水平显著升高, 显著抑制了细胞周期素E和CDK2复合物的形成以及组蛋白 H1的磷酸化修饰, p21启动子活性增强. 利用基因突变技术, 证实p21启动子在-1 185和-1 482 nt之间. 基因突变分析结果表明, HBxAg应答位点与ets因子结合位点重叠. 说明在这一细胞系中, HBxAg可以克服由于p53功能缺失造成的下游p21(waf1/cip1)表达调节的障碍[41-47].

需要强调的是, 目前对HBxAg反式激活的研究结果也存在不一致性, 甚至有矛盾的结果. 因为研究大多数采用瞬时表达系统, 将含有X基因的表达载体与报告基因载体进行共转染实验. 分析其原因可能包括: 体外细胞培养研究单个病毒蛋白的孤立的效应可能与体内整体细胞蛋白的效应不同, 因为体内多种病毒蛋白可能具有协同或拮抗作用; 其次, 转染细胞中蛋白表达水平也会影响观察到的效应, 体外试验中目的蛋白都是过表达, 而病毒蛋白在患者体内水平通常很低; 第一, 不同的细胞类型将有不同的应答; 第二, 细胞培养环境不可能完全真实地反映活体内环境; 最后, 应用报告基因瞬时转染观察的效应不可能完全模拟病毒蛋白对内源性细胞基因的作用[48,49].

关于未知功能新基因的发现是近年来分子生物学领域中的热点问题. 早期的研究工作主要是通过所谓的反向遗传学(reverse genetics)技术, 即首先发现或针对一种生物学现象, 利用蛋白化学和分析化学技术, 将这种生物学现象相关的主要蛋白进行分离纯化, 然后对于纯化的蛋白进行末端部分序列测定, 再根据基因序列编码的简并原则, 设计引物或探针, 进行PCR扩增, 或者对于相应的cDNA文库进行筛选, 以获得相应的编码基因. 因为这一技术相对于遗传学中心法则来说, 不是遗传信息DNA-RNA-蛋白的流向, 而正好与之相反, 因此称为反向遗传学技术. 这一技术的主要缺点就是技术要求高, 过程十分复杂. 以DNA操作技术与功能研究相结合的技术最为有效. 随着核苷酸序列数据库的建立和容量的不断扩大, 以及计算分析技术的不断进步, 随之而来的生物信息学技术在分子生物学研究中的地位越来越重要. 事实证明, 分子克隆技术与生物信息学技术的结合, 是目前克隆和鉴定未知功能基因最有效的研究技术.

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