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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1023-1027
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1023
乙型和丙型肝炎病毒蛋白对14-3-3蛋白信号转导的影响
成军
成军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. C39970674, No. C03011402.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 成军. 乙型和丙型肝炎病毒蛋白对14-3-3蛋白信号转导的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1023-1027
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染靶细胞之后, 在完成自身复制和表达的生活周期的同时, 所产生的病毒大分子, 如肝炎病毒的DNA/RNA和蛋白分子等这些外源性大分子, 对于肝炎病毒感染的靶细胞产生一系列不同的影响[1-7]. 肝炎病毒大分子对于感染靶细胞的这些影响是肝炎病毒感染后致病机制的主要组成部分. 因此, 研究乙型和丙型肝炎病毒的核酸成分和蛋白质成分对肝细胞的影响具有十分重要的意义. 由于肝炎病毒蛋白的产生, 改变了肝炎病毒靶细胞的正常的信号转导途径, 引起细胞的病变, 甚至是恶性转化, 以至于发生肿瘤[8-13]. 14-3-3蛋白家族是细胞主要的信号转导相关蛋白因子, 研究表明, 肝炎病毒对于14-3-3蛋白家族所介导的信号转导也具有显著的影响.

1 14-3-3蛋白家族的组成和主要生物学作用

在目前研究过的所有类型的真核细胞中都有不同的14-3-3家族基因的表达[14-18]. 自然状态的14-3-3蛋白都是以同二聚体(homodimer)或异二聚体(heterodimer)的形式存在, 主要的功能就是作为接头(adapter)蛋白, 与其他蛋白分子结合, 进而调节其他蛋白分子的生物学功能. 因此, 14-3-3蛋白参与许多生物学过程, 如应激(stress)、细胞周期(cell cycle)、细胞凋亡(apoptosis)的调控, 有时还作为接头蛋白、激活剂以及抑制剂等. 目前在美国国立医学图书馆国立生物工程中心建立的核苷酸序列数据库(GenBank)中已经登录了来源于不同生物的133条14-3-3家族蛋白的全长编码基因. 目前已知有7种14-3-3亚型(β、γ、ζ、ε、τ、η、σ)ζ亚型迄今仅在哺乳动物细胞中发现. Miura et al[19]从蛙等生物中克隆到14-3-3 ζ基因, 编码产物由245个氨基酸残基(aa)组成, 与大鼠、牛的14-3-3 ζ同源性为92%, 与人14-3-3 ζ即磷脂酶A2 (phospholipase A2, PLA2)的同源性为92%. Northern blot分析结果表明, 14-3-3 ζmRNA在脑、肺、脾、肾等组织中具有高水平的表达, 在心脏、睾丸中表达水平较低, 在肝脏、胰腺、卵巢、肌肉中表达水平很低. 另外, 基因的3'-非翻译区(3'-UTR)在人、蛙的14-3-3 ζ cDNA中都是高度保守的. 结果表明, 在进化过程中, 14-3-3 ζ基因序列是高度保守的. Ferl et al[20]等的研究以14-3-3保守核心区的序列进行的遗传树分析结果表明, 植物细胞中的14-3-3蛋白可以很清楚地分为2个不同的亚组. 14-3-3蛋白的核心区编码产物具有疏水和亲水双歧性沟槽(amphipathic groove), 是与其他蛋白结合的关键结构位点, 也是14-3-3蛋白中保守的结构域. 相比较而言, 14-3-3蛋白的氨基和羧基末端序列变异较大.

由于14-3-3蛋白家族结合的蛋白类型十分复杂, 因此14-3-3蛋白的生物学功能也十分复杂. 14-3-3蛋白的生物学功能主要是通过其结合蛋白类型来体现的. 14-3-3蛋白与具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点的蛋白结合, 类似含有SH2位点和磷酸酪氨酸结合(phospho-tyrosine binding, PTB)位点的蛋白的功能. Tzivion et al[21]对于14-3-3蛋白的生物学功能进行了初步的总结. 14-3-3蛋白通过对Raf、MLK、MEKK、PI-3激酶、IRS-1等的激活作用, 对信号转导途径进行调节, 通过对Cdc25、Wee1、CDK2、中心体(centrosome)的作用, 对于细胞周期进行调节, 通过对BAD、ASK-1的影响, 对于细胞凋亡进行调节, 通过对FKHRL1、DAF-16、p53、TAZ、TLX-2、组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase)等的调节, 对转录调节过程具有显著的影响. 但与含有SH2、PTB结构位点的蛋白不同, 14-3-3主要介导蛋白-蛋白之间的结合, 并改变结合靶蛋白的生物学功能.

2 14-3-3蛋白对于细胞信号的转导的影响及机制
2.1 14-3-3蛋白与脂肪酸结合蛋白

Odani et al[22]制备了大鼠重组皮肤脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein, FBP)的多克隆抗体, 进行免疫印迹分析时, 发现没有识别30 kD的皮肤FBP, 而是识别15 kD的大鼠皮肤细胞质中的FBP. 这种蛋白存在于大鼠的几种器官以及小鼠的3T3 L1细胞系中. 30 kD 蛋白的蛋白酶消化片段的序列分析结果表明, 这些蛋白是真核细胞信号转导分子14-3-3蛋白家族的混合物. ε亚单位单独存在时, 免疫印迹反应也是阳性结果. 因此认为这种30 kD蛋白就是14-3-3蛋白的ε亚单位. 尽管在一级结构序列上FBP白与14-3-3蛋白亚单位之间没有显著的同源性, 但具有抗体识别的共同的结构域. 已知14-3-3蛋白和FBP都能与一系列共同的蛋白相结合, 因此推测这两种蛋白可以相互作用, 对于其他蛋白的结合产生影响.

2.2 14-3-3蛋白与糖皮质激素受体信号转导

Widen et al[23]研究了14-3-3蛋白与糖皮质激素信号转导之间的关系. 糖皮质激素受体(GR)的功能就是一种配体依赖性的转录因子. 利用亲和层析的技术从去肾上腺的大鼠的肝脏中分离纯化GR, 以期发现未知的细胞质中GR结合蛋白. 结果发现了广泛存在的14-3-3和Raf-1蛋白. Raf-1是Ras下游的信号转导蛋白, 作为GR的结合蛋白得到同时纯化. 在半定量的配体/激活GR分析中, 表明与14-3-3和Raf-1之间有最强的结合活性, 但14-3-3在非配体/非激活状态下也能与GR共同纯化. 经过充分的含盐缓冲液的洗涤, 糖皮质激素也能诱导GR与14-3-3、Raf-1之间的结合. 应用体外免疫共沉淀技术也证实GR与14-3-3蛋白之间的结合. 这些研究结果提示GR与Raf-1存在于大鼠肝脏细胞质同一个蛋白复合体中, 即受体蛋白体(receptosome)中, 可以部分解释糖皮质激素对于Raf-1-Ras信号转导途径的影响的分子机制.

2.3 14-3-3蛋白与胰岛素信号转导

Ogihara et al[24]研究了14-3-3蛋白与胰岛素信号转导之间的相互关系. 胰岛素与其受体结合诱导细胞质中的底物, 即胰岛素受体底物-1(IRS-1)、IRS-2发生磷酸化修饰, 与几种含SH-2结构域蛋白有关. 为了分离鉴定IRS-1结合蛋白, 以32P-标记的重组IRS-1蛋白对于人心脏cDNA表达型文库进行筛选, 得到了ε和ζ亚型的14-3-3蛋白. L6肌管、HepG2、中国仓鼠卵母(CHO)细胞、牛脑组织中都有与14-3-3蛋白结合的IRS-1蛋白. IRS-2是一种结构上与IRS-1相似的蛋白, 与14-3-3蛋白也能结合. 与IRS-1结合的14-3-3蛋白数量, 并不受胰岛素刺激的影响, 但以爪哇酸(okadaic acid)这种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂刺激之后结合数量显著增加. 应用含有磷酸丝氨酸的IRS-1多肽进行的多肽抑制实验(peptide inhibition experiment)结果表明, IRS-1分子中含有3段与14-3-3蛋白结合的位点: Ser-270、Ser-374和Ser-641. 这3个位点中, Ser-270位于IRS-1结合的磷酸丝氨酸位点, 与胰岛素受体的结合有关. 仅含有磷酸丝氨酸结合位点的截短型IRS-1仍保留与14-3-3体内结合的功能. 与IRS-1的抗体进行的免疫共沉淀技术研究结果相比较, 以14-3-3抗体进行的免疫共沉淀研究, 胰岛素刺激之后IRS-1仅在酪氨酸、丝氨酸位点发生较弱的磷酸化修饰. 因此, 14-3-3蛋白可能在胰岛素敏感性方面具有一定的意义, 其机制就是通过与IRS-1之间的相互作用. 磷酸二脂酶3B (phosphodiesterase-3BPDE-3B)是脂肪细胞中主要的磷酸二脂酶, 主要抵抗胰岛素对于脂肪的分解. 胰岛素诱导PDE-3B的磷酸化和激活过程是PI3-K和Akt依赖性的但PDE-3B激活的具体机制目前还不清楚. Onuma et al[25]用酵母双杂交技术研究发现14-3-3 β这种信号转导过程中的重要脚手架蛋白可以与PDE-3B结合, PDE-3B与14-3-3 β的结合在体外也得到证实. 以谷胱甘肽S-转移酶(GST)为标签的14-3-3 β与大鼠脂肪细胞内源性的PDE-3B蛋白结合, 当脂肪细胞受到胰岛素的刺激后这种结合得到增强. 免疫共沉淀技术也证实大鼠脂肪细胞中PDE-3B与14-3-3 β蛋白也能结合, 这种结合也因为受到胰岛素的刺激而增强. 2种PI3-K抑制剂wortmannin和Ly294002可以阻断这种诱导, 表明PI3-K是必须的. 合成的含有Ser-279或-302位点的15肽可以抑制这种结合. 提示胰岛素调节的这些丝氨酸位点的磷酸化参与这一调节过程. 因为IRS-1也可以与14-3-3结合, 在胰岛素激活PDE-3B的过程中, 14-3-3 β作为脚手架蛋白而发挥作用.

2.4 14-3-3蛋白与细胞凋亡调节

Masters et al[26]研究了14-3-3蛋白在细胞凋亡调节中的作用和意义. 14-3-3蛋白具有抑制Bad和其他细胞凋亡相关的蛋白的作用因而认为14-3-3具有促进细胞存活的作用. 应用14-3-3/配体相互作用的特异性抑制剂difopein进行研究, 证实difopein的表达可以诱导细胞凋亡. 应用许多的生长和死亡信号转导因子进行的研究也得出了一致的结论14-3-3/配体之间的结合承接上游促进细胞生存的信号向细胞凋亡核心调节机制转导, 促进细胞的存活. 因为这些上游的激酶信号经常在肿瘤形成过程中被激活, 因此对于difopein在抗肿瘤药物诱导的细胞死亡的作用进行了研究. 发现difopein可增强顺铂的抗肿瘤作用. 这些研究结果表明, 14-3-3通过与Bad等其他配体分子的相互作用, 对细胞的存活至关重要. 抑制14-3-3的功能可能是肿瘤治疗的新靶位.

2.5 14-3-3蛋白与神经系统信号转导

Le Bouffant et al[27]的研究发现, 针对PCTAIRE-1羧基末端的抗体可以识别啮齿类脑中3种不同的蛋白. 分子量最大的一种主要分布在小脑、海马回和脑皮质中. 在电泳中与PCTAIRE-1分子量相似, 并相互作用, 就象重组的PCTAIRE-1与p11、14-3-3蛋白一样. 将p11或14-3-3亲和树脂与洗脱下来的蛋白进行免疫共沉淀分析, 可以获得纯化的全长的PCTAIRE-1蛋白, 并具有激酶活性. 这一结果表明PCTAIRE-1是脑中具有活性的蛋白激酶. PCTAIRE-1催化活性中心对所有的CDK分子都是一样的, 但在酵母双杂交系统中与p11、14-3-3蛋白酶有相互作用. PCTAIRE-1蛋白的氨基末端和羧基末端都参与和p11、14-3-3蛋白质间的相互作用, 提示立体三维结构的形成在蛋白-蛋白相互作用中的重要地位. PCTAIRE-1羧基末端的抗体识别的30 kD的蛋白在脑中几乎所有部位都有分布, 核苷酸数据库搜索证实来源于染色体1q24-1q25位点的262D12片段中包含了这一分子量大约为26 kD蛋白的编码基因序列, 与已知基因序列没有显著的同源性. 但核苷酸序列数据库中有许多DNA序列的局部与其同源性达到100%.

2.6 14-3-3蛋白与马铃薯球蛋白的结合

马铃薯球蛋白(tuberin)是结节硬化复合物2肿瘤抑制基因(tuberous sclerosis complex 2 tumor suppressor gene)的编码产物, 其磷酸化形式是Akt信号转导下游磷脂酰肌醇3'-激酶(phosphatidylinositol 3'-kinase, PI3K)的负调节因子. Liu et al[28]在马铃薯球蛋白分子中鉴定出几种14-3-3的结合位点, 与Akt磷酸化位点相重叠. 马铃薯球蛋抗体的14-3-3 α结合位点特异性抗体的识别与有丝分裂原诱导的马铃薯球蛋白的磷酸化以及Akt α磷酸化底物抗体的识别过程相关. 抑制PI3K的蛋白激酶活性就可以抑制2种抗体对于马铃薯球蛋白的分子的识别. 利用蛋白结构域芯片分析, 含有Ser-939结构位点的多肽是与14-3-3特异性结合的结构位点. 谷光甘肽S-转移酶的pull-down分析结果表明, 与14-3-3的融合蛋白研究结果表明, 所有7种14-3-3亚型都能与马铃薯球蛋白结合. 这种结合受到Ser-939位点磷酸化的多肽片段的竞争性结合抑制, 但是没有磷酸化修饰的多肽不能进行抑制. 马铃薯球蛋白与14-3-3可以进行免疫共沉淀. 这些结果表明, 马铃薯球蛋白分子结构中含有14-3-3、Akt识别的位点.

2.7 14-3-3蛋白与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1

Sato et al[29]研究发现3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1 (3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1, PDK1)在激活蛋白激酶A、G、C中具有重要作用. PDK1在调节Akt Thr-308位点的磷酸化及其活性中具有重要作用. 以前认为PDK1激酶活性是持续性的, 但目前的观点认为受到其他蛋白的调控, 如蛋白激酶C相关激酶2(protein kinase C-related kinase-2, PRK2)、p90/核糖体蛋白S6激酶-2(RSK2)、热休克蛋白90(Hsp90)等. 最近的研究结果表明, PDK1与14-3-3蛋白结合, 结合位点是Ser-241, 可以发生自身磷酸化, 对于其激酶活性至关重要. PDK1可增加与14-3-3蛋白的结合的突变, 降低其体内蛋白激酶活性. 相反, PDK1可降低与14-3-3蛋白的结合的突变, 提高其体内蛋白激酶活性. 野生型PDK1与14-3-3蛋白孵育, 降低其蛋白激酶活性. 可以肯定, PDK1蛋白激酶活性受到14-3-3的负调节, 主要是通过其Ser-241位点的自身磷酸化修饰进行调节.

2.8 14-3-3 σ与细胞周期调节

细胞周期的检验点(checkpoint)在细胞维持稳定过程中具有重要意义. Suzuki et al[30]的最近研究结果表明, 14-3-3 σ在p53的调节作用下, 对于G2/M-期检验点具有重要影响. 为了研究14-3-3σ基因是否在肿瘤细胞中被激活, 对14-3-3 σ基因的5'-非翻译区的甲基化状态进行了研究. 在胃癌、结直肠癌、肝细胞癌等22株肿瘤细胞中, 6株细胞的14-3-3σ的5'-非翻译区有异常的甲基化修饰. 发生甲基化之后14-3-3σ的表达缺如, 这种抑制作用以5-阿扎-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-2'-deoxycytidine)处理可以恢复. DNA损伤后所出现的正常的G2期阻滞, 与此基因的甲基化修饰无关. 43%(26/60)的原发性胃癌14-3-3σ基因高度甲基化, 在低分化腺癌中尤其如此. 发现人的肿瘤中存在14-3-3 σ基因由于甲基化而失活的现象.

3 乙型和丙型肝炎病毒蛋白与14-3-3蛋白家族的信号转导
3.1 丙型肝炎病毒感染对于皮肤中14-3-3蛋白信号转导的影响

Lazaro et al[31]的研究发现皮肤扁平苔藓(cutaneous lichen planus)与慢性HCV感染有关. 但关于HCV是否感染扁平苔藓部位的角质细胞一直不十分清楚. 对于26例慢性HCV感染者皮肤活检标本和24例皮肤扁平苔藓患者(5例有HCV感染, 19例无HCV感染)的正常和皮损部位的皮肤中正链、负链HCV RNA进行原位杂交检测, 在健康皮肤角质细胞中HCV RNA的检出率为69%, 在扁平苔藓皮肤中的检出率为100%. 在没有HCV感染的皮肤苔藓患者的皮肤中没有检测到HCV RNA. 健康皮肤与扁平苔藓皮肤相比较, HCV RNA的检出率显著升高. 认为皮肤角质细胞的HCV感染与皮肤扁平苔藓的发病有关.

Ku et al[17]发现在体内14-3-3蛋白家族成员可以结合人中间丝状蛋白角蛋白18(keratin 18, K18), 而且是细胞周期、磷酸化修饰依赖性的方式. K18的Ser-33位点是磷酸化位点, 在培养细胞的有丝分裂、再生的肝脏中、在体外cdc2磷酸化过程都是如此. 比较野生型和突变型K18 Ser-33-Ala/Asp, 在转染细胞中发现K18 Ser-33位点的磷酸化修饰是K18与14-3-3结合所必需的, 对角蛋白的结构和分布都有影响. K18蛋白另外一个磷酸化位点(Ser-52)或K18 蛋白的糖基化修饰对于K18与14-3-3蛋白之间的结合没有影响. K18 Ser-33位点的磷酸化在与不同的14-3-3蛋白结合中情况不同. K18蛋白磷酸化Ser-33或磷酸化Ser-52形式的特异性抗体研究证实, 尽管Ser-52磷酸化修饰的和Ser-33磷酸化修饰的K18蛋白具有共同的分布, 但这些磷酸化修饰在不同的K18蛋白分子上进行的. K18蛋白的磷酸化是K18与14-3-3蛋白质间结合所必需的, 但不是全部条件. 这种蛋白之间的结合想必是与K18 Ser-33位点磷酸化相关的有丝分裂条件相关, 在角蛋白的亚细胞分布中具有重要意义. 角蛋白Ser-52或Ser-33位点的磷酸化修饰, 决定其亚细胞分布特点[32-35].

3.2 丙型肝炎病毒核心蛋白对14-3-3蛋白信号转导的影响

HCV感染是引起肝脏功能异常的主要原因之一, 流行病学调查结果表明, HCV感染与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)有关. 在HCV编码的蛋白中, 核心蛋白在体内、体外的细胞生长调节中具有重要作用, 但具体机制目前还不十分清楚. 研究表明, 14-3-3家族中的几种蛋白与HCV核心蛋白之间具有结合作用. 4-3-3蛋白与HCV核心蛋白的结合是磷酸丝氨酸依赖性的方式. HCV核心蛋白的表达可引起HepG2细胞和酵母细胞中Raf-1蛋白激酶活性的持续升高, HCV核心蛋白与14-3-3蛋白之间的结合是HCV核心蛋白激活Raf-1蛋白激酶所必需的. 这些结果表明, HCV核心蛋白可能代表了通过与14-3-3相结合激活Raf-1激酶的独特的信号转导通路, 在调节肝细胞生长过程中具有十分重要的作用[36-39].

3.3 乙型肝炎病毒X蛋白对14-3-3蛋白信号转导的影响

Diao et al[40]研究了HBxAg对Fas介导的细胞凋亡具有抑制作用, 对于细胞生存具有促进作用. Fas介导的细胞凋亡是肝脏疾病过程中肝细胞损伤的主要原因. 人原代肝细胞和小鼠胚胎成纤维细胞的实验表明, 抗-Fas抗体诱导的细胞凋亡可被HBxAg的表达所抑制. 这一现象也在缺乏p53表达的小鼠红细胞白血病细胞中得到证实. 说明HBxAg对于细胞凋亡的阻断是p53非依赖性的. 对于HBxAg阻断细胞凋亡的信号转导途径进行研究. SAPK/JNK信号转导途径在Fas介导的细胞凋亡中的细胞存活有重要地位, 激酶活性分析结果表明表达HBxAg的细胞中SAPK活性显著上调. 表达HBxAg的正常的小鼠成纤维胞可以防止死亡, 但缺乏SEK1 的同样的细胞中SAPK信号转导途径, 无论HBxAg表达与否, 都不能阻断Fas介导的细胞凋亡. HBxAg 表达可以抑制细胞受到抗- Fas诱导时胱冬肽酶(caspase ) 3和8的活性, 抑制线粒体细胞色素C的释放. 共沉淀和共聚焦荧光显微图像分析结果表明HBxAg与细胞质中含有MEKK1、SEK1、SAPK、14-3-3蛋白的复合体共同分布. 基因突变分析结果表明HBxAg 分子结构中存在与14-3-3结合的特殊位点对于诱导SAPK/JNK活性以及防止Fas介导的细胞凋亡都有显著的相关性[41-45].

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