丙型肝炎病毒5'-非翻译区的结构与功能研究

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Correspondence to: N/A

Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是含外膜蛋白的单股正链RNA病毒, 属黄病毒科肝炎病毒类. 在大多数感染人群中丙型肝炎病毒表现为持续性感染, 并可导致慢性肝炎、肝硬化, 或肝细胞癌[1,2]. 从不同患者中分离的病毒表现出明显的序列差异, 从同一患者分离的病毒呈现出准种的特点．然而5'-非翻译区(5'-NTR, 5'-nontranslated RNA)在HCV不同基因型却相对保守和稳定, 这种序列保守的特点可能在病毒基因组的复制和翻译中起着重要的作用[3,4]．

1 5'-非翻译区的结构特点

HCV为单股正链RNA, 全长大约9500核苷酸(nt), 含有一个大的开放读码框架(ORF, open reading frame), 位于ORF上游的是5'-NTR[5]. 1991年, Han et al[6]采用引物延长与PCR相结合的方法克隆了HCV 5'-NTR的完整序列, 得到的序列长341 nt, 这一结果亦得到了其他人的证实. 但是, 也有短的HCV 5'-NTR序列的报道, 为319或324 nt[7,8]．这些短的5'-NTR可能是HCV基因组在体内被切割或基因变异的结果．

HCV整个基因组与黄病毒属病毒极为相似, 但HCV 5'-NTR结构却类似瘟病毒属病毒, 而与黄病毒属病毒明显不同[9]. 与瘟病毒属病毒一样, HCV 5'-NTR有3-5个小的ORF. 有关这些小的ORF是否被翻译和有何功能, 目前尚不清楚, Yoo et al[10]认为这些小的ORF可能是HCV病毒蛋白前体翻译的一种负性调节结构. Rijnbrand et al[11]研究发现5'-NTR中含有3-5个AUG三联子, 其中一些AUG在HCV基因组中较为保守, 这5个三联子分别位于13、32、85、96、215 nt. 利用核苷酸诱变方法研究AUG在HCV翻译中的作用, 结果表明13、32、215的AUG变异对蛋白的翻译无明显影响, 而85 nt或96 nt的变异会严重影响内部核糖体进入位点(IRES, internal ribosomal entry site)功能, 并且发现核糖体只能识别342 nt的AUG作为蛋白翻译的启始密码子．

Bukh et al[12]在HCV 5'-NTR中发现了三个高度保守的结构域, 分别位于3-65、178-199、246-263 nt, 后两个区域与病毒的进化有关, 前一个区域毗邻启动多蛋白翻译的真实启动子AUG, Bukh et al认为, 这个结构域对于HCV RNA多蛋白体的翻译至关重要, 这一假设在以后的体内、外翻译实验中陆续得到了证实. 虽然5'-NTR序列保守稳定, 但也发现了一些位于该区的变异. 5'-NTR有限的序列变异基本位于155-170 nt和117-132 nt, 从而形成两个基元(motif)．HCV 5'-NTR发生的核苷酸变异多为互补突变, 两个基元随机发生1-3 nt共突变的机率很小, 说明5'-NTR序列变异不是随机发生的[13,14]．

Brown et al[15]采用计算机模拟折叠程序对5'-NTR保守区进行处理, 计算热力学自由能, 建立了HCV 5'-NTR的二级结构模型, 该结构模型被双链及单链的RNase敏感实验所证实, 即双链及单链RNase可以分别在HCV 5'-NTR的双链区及单链区切割HCV RNA. 根据HCV 5'-NTR二级结构的特征, 可分为4个RNA结构域[16-18]: 结构域I呈发夹状, 位于5-20 nt, 目前认为结构域I的缺失可增强RNA的翻译, 表明其可能具有翻译调节作用; 结构域II是一个大的茎-环结构, 对于其功能仍存在争议, 但大数学者认为结构域II可增强RNA的翻译表达. 结构域III所含核苷酸最多, 结构也最复杂, 由一个长的不规则螺旋结构和多个分枝状茎-环结构组成, 结构域III是蛋白翻译的核心部位, 结构高度保守, 参与形成对蛋白翻译有重要作用的RNA假结; 结构域IV的5'-端是一段短的单链区, 3'-端的小茎环结构与真实启动密码子AUG相连, 部分学者认为结构域IV的稳定能够提高翻译效率．

2 5'-非翻译区的功能

2.1 翻译启动功能

HCV RNA多蛋白前体的翻译启动方式与小RNA病毒相似, 是采用一种不同于一般病毒的独特方式: 核糖体着陆启动病毒多蛋白的翻译. 该领域最早的研究工作是由Tsukiyama-kohara et al[19]开展的. 为探讨HCV RNA的翻译启动方式, 构建了含有两个表达基因的双顺反子表达载体. 第一个顺反子由噬菌体T7启动子和报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)组成, 第二个顺反子, 由HCV cDNA 341-1431 nt序列组成. 选择T7启动子上游酶切位点线性化载体, 在RNA多聚酶作用下体外转录为双顺反子RNA. 然后采用无细胞翻译系统进行体外翻译. 结果发现, HCV C、E1区特异性结构蛋白p22和pg35表达正常．由于在以传统的核苷酸扫描方式启动翻译中, 结合于mRNA5'端帽子上的核糖体不可能在第二个顺反子前如此长距离的滑动, 有理由认为HCV C、E1区蛋白的表达是核糖体越过双顺反子RNA的5'-端直接在其内部着陆, 即是以非帽依赖性方式启动翻译的. 将这种存在于病毒5'-NTR上能与核糖体结合的序列称作IRES．

Pilipenko et al[20]在微小病毒IRES的5'-NTR中发现存在一些重要的序列-基元(motif), 可以与18 S rRNA 35'-端附近的序列互补, HCV IRES也发现同样的基元存在. 以后很多学者如Wang et al[21]陆续证实了以上的发现, 并对IRES结构及功能特点进行了深入研究. 因HCV RNA 5'-NTR序列较其他微小病毒短, 因此HCV的IRES可能具有更紧密的结构, 并且与其他微小病毒相比, IRES占据较多的5'-NTR. Tsukiyama-kohara et al认为IRES的5'-端位于111至257 nt. 然而, Wang et al[22]和Rijnbrand et al[23,24]研究发现IRES的5'-端位于29-69 nt. Reynolds et al[25]的研究认为IRES活性所需的最短序列为HCV RNA基因组核苷酸序列42-356 nt. Honda et al[26]为了解IRES的结构特点, 构建一系列5'-NTR缺失变异的全长HCV cDNA克隆. 当HCV RNA发生核苷酸28-69 nt缺失变异时, 蛋白的翻译明显下降, 与Wang及Rijnbrand研究结果相一致．同时资料显示在蛋白的翻译过程中该区的二级结构是必不可少的, 当茎环结构IIa区(28-69 nt)或IIb区(70-69 nt)碱基对结构发生改变而致二级结构改变时, IRES的功能明显下降. Kalliampakou et al[27]在研究中也发现核苷酸插入或缺失而致结构II区茎环结构改变特别是顶端结构发生改变时, IRES的功能将受到严重的影响, 而在保守的A-81、C-83、C-84、A-93、A-96位发生单个核苷酸替换时, IRES的活性仅受到轻度的影响. 最近的一些研究资料[28]显示结构II区可诱导核糖体40 S亚单位发生构象改变, 同时目前的实验模型表明结构II区茎环结构的顶端在核糖体的E位点或其附近与核糖体发生作用而参与RNA的解码过程, 直至翻译机制建立．根据5'-NTR二级结构的模型结构III区可进一步分为6个包含茎环结构的亚区(即: a-f)．结构III区是IRES的核心部位, 其结构高度保守, 并参与形成RNA假结, 在结构III区的功能研究中, Brown et al[15]发现249-275 nt和296-313 nt发生变异而致结构III区双螺旋结构不稳定时, IRES的活性下降. 155-171、172-227、229-238 nt发生变异时, IRES的翻译启动功能完全丧失; 而且结构III区的二级结构茎环结构IIIa、IIIb、IIIc, 对IRES的功能都起着重要的作用．Jubin et al [29]研究发现位于253-279 nt的IIId区是结构III区中高度保守的区域, 包含两个双链螺旋结构(即: 螺旋结构1区和2区), 该区体内诱变显示其茎环顶端的GGG三联子(266-268 nt)是IRES活性必须结构之一, 序列比较中发现茎环顶端的6位核苷酸(UUGGGU)在HCV基因组中绝对保守, 并且GGG三联子在黄病毒属和瘟病毒属的非翻译区中也高度保守. 同时作者也对IIId区的二级结构特点进行研究, 茎环顶端的单个G突变为C时会影响RNA的折叠方式, 从而导致IRES功能的丧失, 其原因可能是由于G-C突变使IRES与核糖体40S亚基的亲和性降低, 作者认为IIId区的序列及其二级结构均是IRES活性的重要因素. 结构IV区与起始密码子AUG相连, 在RNA的翻译中无明显作用. HCV RNA 5'-端的茎环结构I区缺失却能导致IRES的翻译效率提高, 该区可能具有调节作用．

2.2 5'-NTR的复制功能

5'-NTR在翻译中的作用受到广泛的关注, 并进行了较为细致的研究. 但5'-NTR在RNA复制中的作用却知之较少, 主要是因为HCV RNA缺少有效的细胞复制系统. 2001年, Friebe et al[30]构建了HCV RNA复制子, 该复制子在人肝细胞系Huh-7可以高效表达, RNA由以下几个元件组成: 5'-NTR-IRES 3'-末端, 新霉素磷酸转移酶, 启动非结构蛋白翻译的脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES, NS3-5B, HCV 3'-NTR. 5'-NTR的IRES上游区包括结构I区与结构II区之间的间隔区. IRES上游区核苷酸序列5-20 nt和24-40 nt进行缺失变异, 将变异的双顺反子转染Huh-7细胞, 并进行G418筛选; 与亲代RNA复制相比, 变异RNA无克隆株生长, 同时将双顺反子中的新霉素磷酸转移酶替换为萤虫素酶, 变异RNA萤虫素酶表达活性在4 h、24 h、48 h和72 h与亲代相比都明显下降, 说明5'-非翻译区5-40 nt对HCV RNA的复制是必须的, 研究也发现复制水平会随着5'-NTR 5'-末端序列的延长而不断提高, 当5'-NTR为全长时, 嵌合体RNA复制水平最高. 这种5'-端翻译和复制信号重叠与其他正链RNA不同, 例如: 脊髓灰质炎病毒(PV, polioviral), 其5'-NTR由两部分组成: 5'-末端序列1-88 nt三叶草样结构是RNA复制所必须, 而IRES位于PV基因组序列134-556 nt．

HCV 5'-NTR包含有复制和翻译的作用元件, 为进一步明确复制作用元件, Kim et al[31]将PV的IRES插入到HCV 5'-NTR与新霉素磷酸转移酶开放读码框架之间, EMCV的IRES与HCV(NS3-NS5B)连接. 通过一系列5'-NTR的缺失变异突变, Yoon et al发现含有结构I区和结构II区时HCV嵌合体能够在Huh-7细胞中复制, 当结构I区或结构II区发生缺失时, 嵌合体复制停止; 结构III区和假结结构与结构I区、结构II区连接后, 可明显提高复制水平. Yoon et al认为结构I区和结构II区是HCV RNA复制所必须的结构, 并且5'-NTR的其他结构都在RNA的复制中发挥重要的作用. 结构II区是复制和翻译都必须具有的结构, 这可能是由于结构II区介导复制与翻译的转换. 在PV的研究中发现, 当PV进行翻译时, 其RNA的复制即被阻止, 这种翻译与复制之间的转换认为是由RNA结合蛋白-多聚结合蛋白-2(PCBP2, poly(rC)-binding protein-2)所调控. 多聚结合蛋白也能够与HCV 5'-NTR相结合, 如PCBP-2能够与结构I区和结构II区结合, 但其在HCV复制与翻译中的具体功能目前还不清楚．

5'-NTR在翻译和复制中的功能受到越来越多的关注, 对其深入的研究将为进一步了解HCV感染慢性化机制, 以及药物开发提供新的方向和基础．

备注

$[Footnotes]

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