病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-04-15; 11(4): 385-388
在线出版日期: 2003-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i4.385
酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因
王琳, 李克, 成军, 陆荫英, 张健, 陈天艳, 洪源, 刘妍, 王刚, 钟彦伟
王琳, 李克, 成军, 陆荫英, 张健, 陈天艳, 洪源, 刘妍, 王刚, 钟彦伟, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
王琳, 女, 实验技师, 主要从事肝炎病毒蛋白结合蛋白和分子生物学调节机制的研究.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-14
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15

目的

Hcbp6是与核心蛋白相结合的未知功能蛋白基因, 为了初步提示他的生物学功能和在细胞中的存在形式, 采用酵母双杂交体系寻找与他相互作用的肝细胞蛋白, 探讨Hcbp6的生物功能.

方法

应用酵母双杂交系统3, 构建Hcbp6诱饵质粒并转化酵母AH109, 与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合, 在涂有x--gal营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上筛选生长．挑选蓝色克隆, 提取此酵母克隆的质粒, 转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序, 然后进行生物信息学分析.

结果

筛选出4种与Hcbp6特异性相互作用的蛋白, 包括Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋白.

结论

推测该蛋白可能为一分泌性蛋白, 或与分泌蛋白的形成有关, 进一步的生物学功能的研究需要更多的实验加以探讨.

关键词: N/A
引文著录: 王琳, 李克, 成军, 陆荫英, 张健, 陈天艳, 洪源, 刘妍, 王刚, 钟彦伟. 酵母双杂交技术筛选Hcbp6结合的肝细胞蛋白编码基因. 世界华人消化杂志 2003; 11(4): 385-388
Screening of gene encoding of hepatic proteins interacting with Hcbp6 via yeast two hybridization
Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Yin-Ying Lu, Jian Zhang, Tian-Yan Chen Yuan Hong, Yan Liu, Gang Wang, Yan-Wei Zhong
Lin Wang, Ke Li, Jun Cheng, Yin-Ying Lu, Jian Zhang, Tian-Yan Chen, Yuan Hong, Yan Liu, Gang Wang, Yan-Wei Zhong, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, 26 Fengtai Road Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: October 29, 2002
Revised: November 14, 2002
Accepted: November 28, 2002
Published online: April 15, 2003

AIM

To seek for hepatic proteins that interacted with protein encoded by Hcbp6 for exploring the biological function of Hcbp6.

METHODS

Hcbp6 gene was introduced into pGBKT7, and then transformed into yeast AH109, which was mated with yeast Y187 (αtype) containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing x-α-gal. Plasmids were extracted from positive colonies, and sequence analysis was performed by bioinformatics.

RESULTS

Four kind of proteins including paralemmin, Ran binding protein 2, transmembrane transporting protein and albumin were identified to interact with Hcbp6 specifically.

CONCLUSION

Hcbp6 proteins may belong to or be associated with formation of secretary proteins, more study needs to be done for clarifying its biological function.

Key Words: N/A
0 引言

HCV核心蛋白是病毒编码的一种重要的致病因子, 参与介导多种生物调节和病理反应过程, 其分子机制之一就是病毒与宿主细胞蛋白质间的相互作用. HCBP6是以酵母双杂交技术筛选出能与HCV核心蛋白发生结合的蛋白[1], 这种结合在体外实验得到了明确的证实．该蛋白在哺乳动物中比较保守, 从小鼠、大鼠、奶牛到人具有较高的同源性, 但是目前既没有功能上的研究, 也不知其对核心蛋白的作用. 基于此, 我们再次采用酵母双杂交系统对HCBP6的结合蛋白基因进行筛选, 以期寻找HCBP6可能的生物学功能, 并为研究核心蛋白的致病机制提供一定的线索．

1 材料和方法
1.1 材料

预转化入酵母的对照质粒AH109(MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2: GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2 URA3: MEL1TATA-lacZ MEL1）酵母中含有pGBKT7-53, 编码DNA-BD/鼠p53融合蛋白, Y187（MAT α ura3-52, his3-200, Ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met-, URA3: GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ MEL1) 酵母中含有pTD1-1, 由质粒pACT2中编码AD/SV40大T抗原融合蛋白. 预转化的cDNA肝文库(Y187), 由质粒pACT2表达AD/cDNA文库融合蛋白均购自Clontech公司(PT3183-1). 酵母双杂交系统3 含有pGBKT7 DNA-BD克隆载体、pGADT7 AD克隆载体、pGBKT7-53对照质粒、pGADT7-T对照质粒、pGBKT7-Lam对照质粒、pCL1对照质粒、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae), AH109酵母株、Y187酵母株, 购自Clontech公司(K1612-1). Taq DNA 聚合酶购自MBI公司. T4 DNA连接酶、EcoRI和BamHI购自宝生物公司. c-myc单克隆抗体本室自制, 由购自ATCC的1-9E10.2杂交瘤产生．辣根过氧化物酶酶标羊抗鼠IgG为中山生物公司产品. 醋酸锂购自Sigma公司. 丙烯酰胺、N, N'-亚甲双丙烯酰胺为Promega公司产品, TEMED为宝林曼公司产品. X-α-Gal购自Clontech公司. 培养基: 胰蛋白胨、酵母提取物为OXOID公司产品. 酵母YPDA培养基、SD/-Trp培养基SD/-Leu, SD/-Trp/-Leu, SD/-Trp/-Leu/-His, SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade购自Clontech公司, 半硫酸腺苷购自Sigma公司．

1.2 方法

载体的构建: "诱饵"质粒的建立. 将HCV核心蛋白基因用T4连接酶连于含有GAL4结合域的pGBKT7载体上构成诱饵质粒pGBKT7- Hcbp6, 用醋酸锂法[2]转入酵母细胞AH109后, Western blotting杂交鉴定是否有融合蛋白表达, 并且在四缺培养基上培养排除其自身激活作用．(2)酵母配合实验: 挑取在SD/-Trp培养基上含有pGBKT7- Hcbp6质粒的AH109酵母菌落(>2 mm)数个接种于SD/-Trp液体培养基中, 30 ℃ 250 rpm振摇过夜． 第2天离心后重悬细胞约5 mL, 计数>1×1012.L-1细胞, 室温水浴中融化1份1 mL文库酵母培养物, 全部5 mL的AH109酵母细胞与1 mL的文库混合, 加入45 mL的2 × YPDA后30-50 r.min-1 30 ℃ 培养配合过夜, 24 h后进行离心用YPDA 10mL重悬细胞后铺15 cm的SD/-Trp/-Leu/-His 平板25块和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 25块. 同时进行阳性对照实验及文库滴定. 生长6-18 d后把长出的>2 mm的酵母集落, 在铺有 X-α-Gal的QDO上检查X-α-Gal酶活性, 认为在QDO培养基上生长且出现蓝色菌落的配合为阳性集落. 酵母质粒提取转化大肠杆菌, 按试剂盒提供的操作指南Lyticase法进行. 挑取真正的阳性集落于QDO液体培养基中培养过夜后, 提取酵母质粒, 提取的质粒用电穿孔法[3]转化大肠杆菌, 于含有氨苄青霉素的LB平板培养, 所获得菌落提取质粒后测序. 阳性克隆DNA测序后, 提交GenBank分析, 所获新的基因存入GenBank数据库．

2 结果
2.1 Hcbp6蛋白表达的鉴定

"诱饵"载体pGBKT7- Hcbp6构建后转化到酵母AH109后能够稳定表达HCBP6融合蛋白(图1). 阳性对照组含有DNA结合片段Gal41-147氨基酸及c-myc标签的总分子量18200, 实验组因表达HCBP6融合蛋白其分子量为38985． Western免疫印迹分析结果显示转化pGBKT7质粒组在14200后有一特异表达带, 转化pGBKT7-Hcbp6质粒的酵母提取物于40000左右有明显条带, 而未转化质粒组缺乏特异性反应带, 其分子量大小与理论值相符合．

图1
图1 pGBKT7-Hcbp6蛋白Western免疫印迹分析. 1: pGBKT7阳性对照组 2: pGBKT7-Hcbp6实验组.
2.2 部分筛选克隆BglⅡ酶切鉴定结果

pACT2内含有两个BglⅡ酶切位点, 分别位于多克隆位点两侧, 使用该酶消化将释放出肝细胞文库片段(图2)．

图2
图2 1-5种不同的克隆Bgl Ⅱ酶切鉴定.
2.3 cDNA测序与同源性分析初步结果

挑选8个克隆测序, 与GenBank数据库进行初步比较, 已知基因的部分序列高度同源(99%)(表1)．

表1 1-5种阳性克隆与GenBank同源序列比较.
编号已知的同源序列编码蛋白相同克隆数同源性
1血清白蛋白(alb)299
2Paralemmin(PALM)199
3Ran结合蛋白2, (Ranbp2)299
4跨膜运输蛋白21(TMP21)199
5DNA序列299
3 讨论

HCV核心蛋白为一个多功能蛋白, 除组成蛋白衣壳外, 还能作用于多种病毒和细胞的启动子, 调控基因转录, 干扰其他病毒的复制, 促进宿主细胞的分化和恶化, HCV的基因组为正链RNA病毒, 但是其复制和表达均在胞质内完成, 不涉及到逆转录过程, 核心蛋白的存在为HCV感染后致肝癌的发生机制提供基础[4-10]. 但是有关核心潜在的生物学功能还远不为人们了解, 在以酵母双杂交技术寻找与核心蛋白相互作用的蛋白质时, 我们分离并确定了未知功能蛋白基因Hcbp6. Hcbp6是日本等学者在小鼠肾等器官中进行cDNA文库测序时发现的, 蛋白全长190 aa, Genbank中的资料显示该基因在哺乳动物中较为保守, 组织分布广泛, 在人和小鼠的不同组织中存在不同的基因剪切型, 可以认为这是一个不断进化中的古老基因. 绿色荧光(EGFP)融合蛋白分析发现HCBP6以小泡状结构散布于核周的胞质或细胞器内, 而EGFP空白对照则均匀弥散于整个细胞质及核质中, 因此推测HCBP6可能以分泌蛋白的形式由内浆网和高尔基体合成并运输. 为了进一步探讨该未知蛋白的功能, 本实验再次以酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选HCBP6的结合蛋白, 以期发现其部分下游信息和对HCV核心致病机制的影响.

我们此次共获得了8个阳性克隆, 经测序及回交分析证实了Paralemmin(PALM)、Ran结合蛋白2(Ranbp2)、跨膜运输蛋白21(Tmp21)和血清白蛋(alb)白四种特异性结合蛋白. Tmp21是p24货物受体家族成员之一, 他与p24a被认为是COPⅠ小囊泡外衣蛋白的受体成分, 广泛分布于各类组织细胞内的微粒体膜、酶原颗粒膜和质膜表面, 与酵母蛋白Emp24p有部分同源性, 推测其功能与分泌蛋白从内浆网到高尔基体的运输以及小囊泡的寻靶作用有关. 免疫荧光实验显示此蛋白连续循环于中间区室元件(IC)和高尔基网络间, 侧面证实了他在高尔基器分泌通路中的运输行为[11-15]. PALM是一类推定的有关质膜融合的调节蛋白, 在人类不同组织细胞内均有表达, 神经元细胞中高丰度表达. PALM与一类涉及到如吞噬、胞吐、突起形成、信号转导等快速质膜动力学事件的蛋白分子具有分子结构或免疫形态学上的共同特征, 以其羧基末端的CaaX基序通过脂类锚定在质膜内表面, 而氨基末端的卷曲螺旋可能具有象t-SNATE蛋白一样介导细胞内膜的小囊泡插入的活性. 有实验观察到过度表达的PALM确实可以扩张细胞边缘、放射出长的突起而形成奇怪的多叶型. PALM也结合在微粒体和小囊泡等细胞内组分上, 推测同时存在小囊泡运输的活性[16-20]. 另外一个感兴趣的蛋白质RanBP2定位于核孔复合物的浆膜侧并构成Ran-GTP酶在核浆膜面的结合域, 辅助Ran信号传导通路中的各种核过程包括核蛋白的双向运输、mRNA的加工和输出及细胞周期的调节[21-33]. HCBP6与他的结合可能导致某些核功能的建立或改变, 也可以想象, 这种作用可能对HCV核心蛋白的核内转运有影响．

从本实验结果来看, HCBP6与多种负责细胞内运输的蛋白发生结合, 提示其可能为一种分泌性蛋白质, 但是通过生物软件初步分析没有发现典型的信号肽序列, 因此需要更多的实验如免疫荧光实验观察他的亚细胞定位和体内运输行为, 进而揭示此蛋白的生物学功能. 本实验采用的酵母双杂交技术是研究蛋白质间相互作用的经典方法, 具有假阳性率低、部分模拟体内环境等优点, 同时是建立全部蛋白质-蛋白质组相互作用及其功能关系的图谱的重要手段, 为提示蛋白质在作用网络中所起的作用提供一条快速、便捷的途径[31-33]．

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