基础研究
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世界华人消化杂志. 2015-10-08; 23(28): 4482-4489
Published online 2015-10-08. doi: 10.11569/wcjd.v23.i28.4482
慢病毒-HBx表达载体的构建及其在人正常肝细胞系Chang liver的稳定表达
鲁琰, 朱明月, 张雪儿, 李伟, 董栩, 陈栘, 林波, 郭峻莉, 李孟森
鲁琰, 朱明月, 李伟, 董栩, 陈栘, 林波, 郭峻莉, 李孟森, 海南医学院分子生物学重点实验室 海南省肿瘤发生与干预重点实验室 海南省海口市 571199
张雪儿, 海南医学院2013级临床医学本科班 海南省海口市 571199
李孟森, 海南医学院肿瘤研究所 海南省海口市 570102
鲁琰, 研究实习员, 主要从事肿瘤分子生物学方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, Nos. 81560450, 81360307, 81260306, 81160261, 31060164; 海南省社会发展专项基金资助项目, No. 2015SF03; 海南省重点科技基金资助项目, No. DZXM20110038; 海南医学院培育基金资助项目, No. HY2013-19; 海南医学院大学生创新计划基金资助项目, No. HYCX2014031.
作者贡献分布: 鲁琰与朱明月负责慢病毒-HBx表达载体的构建、蛋白表达的检测, 研究数据的分析及论文撰写; 张雪儿负责细胞的培养和蛋白质提取; 李伟、董栩及陈栘负责表达载体转染和表达的检测; 林波负责测序与分析; 郭峻莉与李孟森负责研究内容的设计、研究数据的分析以及论文的撰写与审校.
通讯作者: 李孟森, 研究员, 571199, 海南省海口市学院路3号, 海南医学院, 海南省肿瘤发生和干预重点实验室. mengsenli@163.com
收稿日期: 2015-06-27
修回日期: 2015-08-18
接受日期: 2015-08-31
在线出版日期: 2015-10-08
Abstract

目的: 构建乙型肝炎病毒X基因(hepatitis B virus x, HBx)慢病毒表达载体, 建立稳定表达HBx蛋白的人正常肝细胞系Chang liver-HBx.

方法: 应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)方法从质粒中扩增HBx基因, 并克隆到慢病毒pEB-3xflag-GP-Puro载体上, 经PCR、酶切和测序鉴定正确后经慢病毒包装感染人肝细胞Chang liver, 再用嘌呤霉素筛选出稳定表达HBx蛋白的细胞株, 最后用免疫荧光和Western blot技术检测HBx蛋白的表达.

结果: 酶切鉴定和基因测序证实HBx基因成功克隆到慢病毒表达载体上, 重组慢病毒经包装纯化后获得滴度为1×108 TU/mL, 用包装好的重组慢病毒感染人肝细胞Chang liver, 经嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞株Chang liver-HBx, 利用免疫荧光和Western blot技术检测发现细胞株Chang liver-HBx可稳定表达HBx蛋白.

结论: 成功构建了HBx的重组慢病毒表达载体, 获得了稳定表达HBx的Chang liver细胞系Chang liver-HBx, 为进一步研究HBx诱导正常肝细胞恶性转化提供细胞模型.

Keywords: 乙型肝炎病毒X蛋白; Chang liver细胞; 慢病毒载体

核心提示: 乙型肝炎病毒X(hepatitis B virus x, HBx)是诱导肝细胞恶性转化的关键分子. 研究发现HBx能激活生长信号, 或抑制P53的转录调节功能, 促进肝细胞的恶性转化. 本研究成功构建pEB-GFP-HBx载体, 并成功转染Chang Liver细胞, 为研究HBx诱导肝细胞恶性转化建立了细胞模型.