基础研究
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世界华人消化杂志. 2015-01-18; 23(2): 179-188
Published online 2015-01-18. doi: 10.11569/wcjd.v23.i2.179
沉默FABP-5基因对人肝癌HepG2细胞的影响
周玲丽, 曹骥, 李薇, 罗旺, 杨香娣, 杨春, 骆成飘, 唐艳萍, 李瑗
周玲丽, 曹骥, 李薇, 罗旺, 杨香娣, 杨春, 骆成飘, 唐艳萍, 李瑗, 广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部 广西壮族自治区南宁市 530021
周玲丽, 李薇, 罗旺, 杨香娣, 广西医科大学研究生学院 广西壮族自治区南宁市 530021
周玲丽, 在读硕士, 主要从事肝癌病因学、发病机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30960428.
作者贡献分布: 此课题由曹骥设计; 研究过程由周玲丽、李薇、罗旺、杨香娣、杨春、骆成飘、唐艳萍及李瑗操作完成; 数据分析与论文写作由周玲丽与曹骥完成.
通讯作者: 曹骥, 副研究员, 530021, 广西壮族自治区南宁市双拥路22号, 广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部. caojicn@163.com
收稿日期: 2014-10-20
修回日期: 2014-11-09
接受日期: 2014-11-18
在线出版日期: 2015-01-18
Abstract

目的: 研究RNA干扰技术的重组慢病毒载体沉默人肝癌HepG2细胞中表皮脂肪酸结合蛋白-5(fatty acid binding protein-5, FABP-5)基因对其增殖、凋亡和侵袭力的影响及作用机制.

方法: 构建3个靶向FABP-5基因shRNA载体, 并筛选出最有效的靶点. 将HepG2细胞分为3组: 实验组用FABP-5基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-FABP-5)感染HepG2细胞; 阴性对照组用空载慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC组)感染HepG2; 空白对照组正常培养. 应用RT-PCR、实时荧光定量PCR检测FABP-5基因mRNA的表达; Western blot技术检测各组细胞FABP-5蛋白的相对表达; MTT法测定细胞体外增殖能力; Giemsa染色法检测细胞的克隆形成; 细胞侵袭小室法检测各组细胞的体外侵袭力; 流式细胞技术(flow cytometry, FCM)检测各组细胞增殖和凋亡的变化情况.

结果: 通过测序验证构建的FABP-5-shRNA表达载体, 感染人肝癌HepG2细胞, 荧光显微镜观察到细胞感染率>90%. Real-time PCR和Western blot结果得出: 相比空白对照组和阴性对照组, 实验组的3种靶点FABP-5-shRNA干扰序列中, LV-shRNA-FABP-5(1)靶点中FABP-5表达的敲减率最高(P<0.05), 筛选出此组为最佳靶点; MTT法结果提示: 实验组细胞490 nm处的吸光度(A)值在转染后第1-5天时均低于阴性对照组、空白对照组, 差别有统计学意义(P<0.05). Giemsa染色法结果显示: 稳定转染HepG2细胞后细胞的增殖能力明显下降(P<0.05); 细胞侵袭小室实验显示: 与空白对照和阴性对照组相比, 实验组细胞的侵袭力明显受到抑制(P<0.05); 流式细胞技术检测发现实验组的细胞相对于阴性对照组出现了明显的凋亡(P<0.05). 实验组较阴性对照组、空白对照组G2/M期延长, G1期缩短, 差别具有统计学意义(P<0.05).

结论: 人肝癌HepG2细胞中沉默FABP-5基因可以有效抑制其表达, 能够降低肝癌细胞的侵袭力, 抑制肝癌细胞的增殖, 将细胞周期阻滞于G2/M期, 使其凋亡显著增加.

Keywords: 肝癌; RNA干扰; 表皮型脂肪酸结合蛋白基因

核心提示: 本研究采用慢病毒为载体, 将表皮型脂肪酸结合蛋白(fatty acid binding protein-5)-shRNA质粒转入人肝癌HepG2细胞后, 有效阻滞了肝癌细胞周期进程, 凋亡大幅增加, 可明显降低肝癌生长增殖功能, 抑制肿瘤细胞的侵袭力.