研究快报
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世界华人消化杂志. 2014-02-08; 22(4): 553-562
Published online 2014-02-08. doi: 10.11569/wcjd.v22.i4.553
RNA干扰技术沉默MCM7基因对人肝癌SMMC-7721细胞生物学行为的影响
孙雯, 曹骥, 卢晓旭, 朱伶群, 杨春, 欧超, 骆成飘, 李瑗, 苏建家
孙雯, 曹骥, 卢晓旭, 朱伶群, 杨春, 欧超, 骆成飘, 李瑗, 苏建家, 广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部 广西壮族自治区南宁市 530021
孙雯, 卢晓旭, 朱伶群, 广西医科大学研究生学院 广西壮族自治区南宁市 530021
孙雯, 在读硕士, 主要从事肝癌病因学、发病机制方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30960428; 广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研基金资助项目, No. Z2012352.
作者贡献分布: 此课题由曹骥设计; 研究过程由孙雯、卢晓旭、朱伶群、杨春、欧超、骆成飘、李瑗及苏建家操作完成; 数据分析和论文写作由孙雯与曹骥完成.
通讯作者: 曹骥, 副研究员, 530021, 广西壮族自治区南宁市双拥路22号, 广西壮族自治区肿瘤防治研究所实验研究部. caojicn@163.com
电话: 0771-5310593
收稿日期: 2013-11-14
修回日期: 2013-12-04
接受日期: 2013-12-12
在线出版日期: 2014-02-08
Abstract

目的: 探讨微小染色体维持蛋白7(mini-chromosome maintenance protein 7, MCM7)基因沉默后对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖和凋亡的影响及可能作用机制.

方法: 利用RNA干扰技术, 构建4个靶向MCM7基因shRNA载体(MCM7-shRNA表达载体), 并对不同靶点进行有效筛选. 将人肝癌细胞系SMMC-7721接种于六孔板, 分为3组: 以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721, 作为实验组; 以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721, 作为阴性对照组; 空白对照组常规培养, 不做任何处理. 应用RT-PCR、实时荧光定量PCR和Western blot技术检测MCM7基因mRNA和蛋白的表达, 评价干扰效果并筛选有效靶点; MTT法检测细胞体外增生能力, Giemsa染色法检测各组细胞的克隆形成; 流式细胞技术(flow cytometry, FCM)分别检测各组细胞增殖和凋亡的变化情况.

结果: 成功构建MCM7-shRNA表达载体, 经测序验证无误, 感染SMMC-7721细胞后, 细胞荧光显示感染率>90%, 内源性靶点得到确认. Western blot及Real-time PCR结果显示: 实验组的四种靶点MCM7-shRNA干扰序列中, 与阴性对照组和空白对照组比较, MCM7 mRNA和MCM7蛋白的表达水平下调均达50%以上, 其中以LV-shRNA-MCM7(4)靶点敲减效率最高, 分别达88.95%、87.89%和82.25%、81.63%, 差异具有统计学意义(P<0.05), 以此作为实验组. MTT法结果显示: 实验组细胞490 nm处的吸光度(A)值在转染后24、48、72和96 h时均低于阴性对照组、空白对照组, 差别显著(P<0.05). 同时Giemsa染色法结果显示: LV-shRNA-MCM7组的克隆形成率(6.00%±0.50%)明显低于空白对照组(14.10%±0.36%)、阴性对照组(13.73%±0.17%), 实验组细胞生长明显受到抑制(P<0.05). 流式细胞技术显示: 实验组较阴性对照组、空白对照组G1期延长, S期缩短, 差别显著(P<0.05). 实验组细胞凋亡率为(22.27%±1.22%), 明显高于阴性对照组(0.05%±0.07%)和空白对照组(0.03%±0.06%), 实验组较阴性对照组、空白对照组出现了明显的细胞凋亡(P<0.05).

结论: MCM7基因的RNAi重组体可以有效地抑制MCM7基因的表达, RNA干扰技术沉默MCM7基因能够抑制肝癌细胞的生长, 阻滞细胞期于G1期, 促进其凋亡.

Keywords: 肝癌; MCM7; RNA干扰; 基因治疗

核心提示: 本实验利用慢病毒为载体, 采用慢病毒转染法将MCM7-shRNA质粒转入人肝癌SMMC-7721细胞后, 肝癌细胞周期进程得到有效阻滞, 凋亡大幅增加, 可明显抑制肝癌生长增殖功能.