修回日期: 2013-12-04
接受日期: 2013-12-12
在线出版日期: 2014-02-08
目的: 探讨微小染色体维持蛋白7(mini-chromosome maintenance protein 7, MCM7)基因沉默后对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖和凋亡的影响及可能作用机制.
方法: 利用RNA干扰技术, 构建4个靶向MCM7基因shRNA载体(MCM7-shRNA表达载体), 并对不同靶点进行有效筛选. 将人肝癌细胞系SMMC-7721接种于六孔板, 分为3组: 以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721, 作为实验组; 以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721, 作为阴性对照组; 空白对照组常规培养, 不做任何处理. 应用RT-PCR、实时荧光定量PCR和Western blot技术检测MCM7基因mRNA和蛋白的表达, 评价干扰效果并筛选有效靶点; MTT法检测细胞体外增生能力, Giemsa染色法检测各组细胞的克隆形成; 流式细胞技术(flow cytometry, FCM)分别检测各组细胞增殖和凋亡的变化情况.
结果: 成功构建MCM7-shRNA表达载体, 经测序验证无误, 感染SMMC-7721细胞后, 细胞荧光显示感染率>90%, 内源性靶点得到确认. Western blot及Real-time PCR结果显示: 实验组的四种靶点MCM7-shRNA干扰序列中, 与阴性对照组和空白对照组比较, MCM7 mRNA和MCM7蛋白的表达水平下调均达50%以上, 其中以LV-shRNA-MCM7(4)靶点敲减效率最高, 分别达88.95%、87.89%和82.25%、81.63%, 差异具有统计学意义(P<0.05), 以此作为实验组. MTT法结果显示: 实验组细胞490 nm处的吸光度(A)值在转染后24、48、72和96 h时均低于阴性对照组、空白对照组, 差别显著(P<0.05). 同时Giemsa染色法结果显示: LV-shRNA-MCM7组的克隆形成率(6.00%±0.50%)明显低于空白对照组(14.10%±0.36%)、阴性对照组(13.73%±0.17%), 实验组细胞生长明显受到抑制(P<0.05). 流式细胞技术显示: 实验组较阴性对照组、空白对照组G1期延长, S期缩短, 差别显著(P<0.05). 实验组细胞凋亡率为(22.27%±1.22%), 明显高于阴性对照组(0.05%±0.07%)和空白对照组(0.03%±0.06%), 实验组较阴性对照组、空白对照组出现了明显的细胞凋亡(P<0.05).
结论: MCM7基因的RNAi重组体可以有效地抑制MCM7基因的表达, RNA干扰技术沉默MCM7基因能够抑制肝癌细胞的生长, 阻滞细胞期于G1期, 促进其凋亡.
核心提示: 本实验利用慢病毒为载体, 采用慢病毒转染法将MCM7-shRNA质粒转入人肝癌SMMC-7721细胞后, 肝癌细胞周期进程得到有效阻滞, 凋亡大幅增加, 可明显抑制肝癌生长增殖功能.