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shRNA maspin/pGenesil-1.1表达载体的构建及意义
倪江涛, 杨紫汐, 泸州医学院病理教研室 四川省泸州市 646000
易永芬, 重庆医科大学病理教研室, 分子医学与肿瘤研究中心 重庆市 400016
倪江涛, 讲师, 主要从事消化系肿瘤的研究.
基金项目: 重庆市教委科研基金资助项目, No. 040310.
作者贡献分布: 此课题由倪江涛与易永芬设计; 基因重组、RT-PCR和Western blot检测由倪江涛与杨紫汐完成; 数据分析由倪江涛完成; 论文写作由倪江涛与易永芬完成.
通讯作者: 易永芬, 教授, 400016, 重庆市渝中区医学院路1号, 重庆医科大学病理教研室, 分子医学与肿瘤研究中心. yiyongfen1953@yahoo.com.cn
电话: 023-68485789
收稿日期: 2013-11-26
修回日期: 2013-12-05
接受日期: 2013-12-12
在线出版日期: 2014-02-08
修回日期: 2013-12-05
接受日期: 2013-12-12
在线出版日期: 2014-02-08
Abstract
目的: 构建maspin基因shRNA真核表达载体, 为进一步研究maspin基因在胃癌细胞株MKN-28生长、浸润、转移中的作用奠定基础.
方法: 设计合成针对maspin基因的shRNA与表达绿色荧光蛋白的pGenesil-1.1质粒连接, 构建的重组质粒分别命名为阳性质粒maspin/pGenesil和阴性质粒YX/pGenesil. 分别用RT-PCR和Western blot检测转染重组质粒前后胃癌细胞株MKN-28 maspin的表达变化.
结果: 通过凝胶电泳和DNA测序分析, 成功构建针对maspin特异性shRNA真核表达质粒maspin/pGenesil及YX/pGenesil. RT-PCR与Western blot检测发现转染成功后maspin/pGenesil组比YX/pGenesil组maspin mRNA的表达显著下降(0.127±0.02 vs 0.510±0.01, P<0.05); maspin/pGenesil组比YX/pGenesil组maspin蛋白表达也显著下降(0.24±0.10 vs 0.65±0.09, P<0.05).
结论: 成功构建了重组质粒maspin/pGenesil, 经转染能有效抑制人胃癌细胞株MKN-28 maspin基因的表达.
Keywords: Maspin; shRNA; 胃癌
核心提示: 根据shRNA设计原则, 设计针对maspin基因编码区的RNA干扰靶位点, 构建了2个RNAi质粒表达载体即: maspin/pGenesil(阳性对照)、YX/pGenesil(阴性对照). 最后, 通过RT-PCR与Western blot检测发现阳性质粒转染成功后可显著下调胃癌细胞株maspin的表达.