基础研究
Copyright ©The Author(s) 2012. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2012-03-18; 20(8): 638-643
Published online 2012-03-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i8.638
慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立
余桂芳, 严跃红, 王瑞鑫, 李显波, 曾文铤, 朱科伦
余桂芳, 严跃红, 王瑞鑫, 李显波, 广州医学院第五附属医院内一科 广东省广州市 510700
曾文铤, 朱科伦, 广州医学院第一附属医院肝病研究室 广东省广州市 510120
基金项目: 广东省科技计划基金资助项目, No. 2010B060900092.
作者贡献分布: 此课题由余桂芳、严跃红、曾文铤及朱科伦设计; 研究过程由余桂芳、严跃红及李显波操作完成; 数据分析由王瑞鑫与李显波完成; 本论文写作由余桂芳完成.
通讯作者: 余桂芳, 主治医师, 510700, 广东省广州市黄埔区港湾路621号, 广州医学院第五附属医院内一科.yuguifang2004@163.com
电话: 020-32213996
收稿日期: 2011-11-13
修回日期: 2012-01-19
接受日期: 2012-03-10
在线出版日期: 2012-03-18
Abstract

目的: 构建乙型肝炎病毒X基因(HBV X)重组慢病毒表达载体, 建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的HepG2细胞系.

方法: 应用PCR法从质粒pIERES2-EGFP-HBV中扩增X基因片段, 克隆至慢病毒载体pZac2.1, 应用PCR、酶切和测序鉴定正确后, 经病毒包装, 感染HepG2细胞, 经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株, RT-PCR、免疫组织化学、Western blot鉴定HBx的表达.

结果: 酶切鉴定和基因序列测定证实长度为489 bp的HBx基因成功克隆至慢病毒表达载体pZac2.1-HBx; 重组慢病毒经包装、纯化后获得滴度为1×108 TU/mL, 通过感染HepG2细胞株和嘌呤霉素筛选, 8-10 d形成生长形态良好的单克隆细胞株HepG2-HBx; RT-PCR鉴定显示细胞株HepG2-HBx在3 d, 14 d, 30 d和2 mo后均可见稳定表达的HBx mRNA; 利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法鉴定, 细胞株HepG2-HBx可稳定表达HBx蛋白.

结论: 成功构建了HBV X重组慢病毒载体, 获得稳定表达HBx的HepG2细胞系, 为进一步研究HBx的生物学功能及致病机制提供细胞模型.

Keywords: 乙型肝炎病毒; X基因; HepG2; 慢病毒; 稳定细胞株