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世界华人消化杂志. 2011-07-08; 19(19): 2016-2021
Published online 2011-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i19.2016
Published online 2011-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i19.2016
成人原代肝细胞的分离、培养及冻存
杭化莲, 张磊, 卞建民, 南京医科大学附属南京第一医院普外科 江苏省南京市 210006
施晓雷, 丁义涛, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科 江苏省南京市 210008
杭化莲, 主治医师, 医学博士, 主要从事肝胆疾病的研究.
作者贡献分布: 此课题由杭化莲、施晓雷及丁义涛设计; 研究过程由杭化莲、张磊及施晓雷操作完成; 研究所用试剂及分析工具由丁义涛提供; 数据分析由杭化莲完成; 本论文写作由杭化莲、张磊及卞建民完成.
通讯作者: 丁义涛, 主任医师, 210008, 江苏省南京市, 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科. yitaoding@hotmail.com
收稿日期: 2011-04-27
修回日期: 2011-06-21
接受日期: 2011-06-28
在线出版日期: 2011-07-08
修回日期: 2011-06-21
接受日期: 2011-06-28
在线出版日期: 2011-07-08
Abstract
目的: 建立一种稳定的成人原代肝细胞分离、培养、冻存方法, 为肝细胞移植、生物人工肝支持系统治疗急慢性肝病以及肝细胞体外应用模型提供潜在的肝细胞资源.
方法: 20例供肝采用离体两步胶原酶灌注技术分离成人原代肝细胞. 选择7个不同的预培养时间点(2、6、12、24、36、48和72 h), 分离所获肝细胞按上述不同预培养时间在4 ℃人无血清培养基(HepatoZYME-SFM)中培养, 然后收集预培养肝细胞转移到含100 mL/L胎牛血清和DMSO的HepatoZYME-SFM中, 再立即放入-80 ℃异丙醇冷冻盒过夜, 次日投入液氮. 分析比较各肝细胞在解冻后细胞活力率、贴壁率、白蛋白分泌及尿素合成.
结果: 在部分肝叶切除后使用离体两步胶原酶灌流技术分离所得肝细胞活率和贴壁率分别是75.0%±4.6%和72.0%±6.0%. 4 ℃预培养12或24 h被证明是最适预培养时间, 这两个时间点的白蛋白分泌高于其他时间点(P<0.05). 与立即冷冻组相比较, 预培养12或24 h肝细胞解冻后活力(61.4%±4.8%, 62.0%±5.6% vs 53.4%±4.2%)、贴壁率(63.2±5.8%, 62.6±3.6% vs 55.2±4.6%)、白蛋白分泌及尿素合成水平明显提高(均P<0.05).
结论: 人肝细胞在冷冻前4 ℃预培养12-24 h可以获得较理想的肝细胞, 为药理毒理学、生物人工肝以及细胞治疗的临床应用提供了可能性.
Keywords: 人原代肝细胞; 肝细胞分离; 冷冻保存