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靶向Skp2基因siRNA对大肠癌细胞生物学特性的影响
解方为, 彭永海, 张霞, 欧阳学农, 中国人民解放军南京军区福州总医院肿瘤科 福建省福州市 350025
解方为, 博士, 主要从事肿瘤内科治疗方面的研究.
作者贡献分布: 此课题由解方为设计; 研究过程由解方为、彭永海、张霞及欧阳学农操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由彭永海提供; 数据分析由张霞完成; 本论文写作由解方为完成.
通讯作者: 解方为, 350025, 福建省福州市, 中国人民解放军南京军区福州总医院肿瘤科. zjxfw@tom.com
电话: 0591-22859444
收稿日期: 2009-01-05
修回日期: 2009-01-19
接受日期: 2009-02-09
在线出版日期: 2009-03-18
修回日期: 2009-01-19
接受日期: 2009-02-09
在线出版日期: 2009-03-18
Abstract
目的: 设计和构建Skp2特异性的siRNA真核表达载体, 观察Skp2siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生物学特性的影响.
方法: 人工合成Skp2基因干扰序列并定向插入到RNAi真核表达载体pRNAT-U6.1/Neo, 通过测序鉴定. 用脂质体介导的基因转染方法转入HCT116细胞, 经G418筛选出稳定转染的细胞系, 半定量RT-PCR方法检测靶基因的表达. 流式细胞技术分析细胞周期分布, MTT比色法检测细胞的生长抑制率.
结果: 测序表明Skp2干扰序列完全正确. RT-PCR结果显示2条Skp2siRNA真核表达质粒均能有效抑制核干细胞因子mRNA的转录表达(P<0.05). MTT比色法检测显示, 与阴性对照组及未转染组细胞比较, 干扰组细胞增殖率明显下降(29.21%±1.40%, 30.10%±1.50% vs 49.05%±4.50%, 53.03%±4.92%, 均P<0.05). 流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多, 即表现为G1期阻滞, S期细胞的比例降低.
结论: 成功构建了Skp2干扰真核表达载体, siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞Skp2mRNA表达, 细胞增殖能力减弱, 为大肠癌基因治疗的可行性提供了有力的证据.
Keywords: Skp2基因; 肠肿瘤; RNA干扰; 基因表达