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世界华人消化杂志. 2009-09-18; 17(26): 2662-2666
Published online 2009-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i26.2662
Published online 2009-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i26.2662
P21真核表达载体的构建及其对HepG2细胞增殖的影响
邱荣元, 何生松, 陈锋, 庞然, 杨凯凯, 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科 湖北省武汉市 430022
邱荣元, 在读博士, 主要从事肝脏疾病的研究.
作者贡献分布: 邱荣元与何生松对此文所作贡献均等; 邱荣元与何生松负责课题设计; 邱荣元、陈锋及庞然负责实验操作; 杨凯凯负责数据的整理及统计分析; 邱荣元与何生松负责论文撰写.
通讯作者: 何生松, 教授, 主任医师, 430022, 湖北省武汉市解放大道1277号, 武汉协和医院感染科. shengshe168@yahoo.com.cn
电话: 027-85726132
收稿日期: 2009-06-11
修回日期: 2009-08-03
接受日期: 2009-08-10
在线出版日期: 2009-09-18
修回日期: 2009-08-03
接受日期: 2009-08-10
在线出版日期: 2009-09-18
Abstract
目的: 构建核定位信号突变型P21基因的真核表达载体并初步探讨其功能.
方法: 采用基因定点诱变技术获得核定位信号突变型P21基因. 采用DNA重组技术, 将突变型P21基因亚克隆至pDsRed1-C1真核表达质粒中, 重组为pDsRed1-C1-P21NLS-. 酶切鉴定及DNA测序, 脂质体转染HepG2细胞, RT-PCR检测目的基因pDsRed1-C1-P21NLS-的表达, 荧光显微镜观测目的基因亚细胞定位, 台盼蓝拒染法检测质粒转染HepG2细胞生长曲线.
结果: 成功克隆了核定位信号野生型及突变型P21基因, 成功构建了pDsRed1-C1-P21WT及pDsRed1-C1-P21NLS-重组质粒, 酶切片段分别为4.7和0.5 kb, 酶切鉴定正确, 测序结果与GenBank核酸序列数据库比对表明, 核定位序列中共9个核苷酸发生变异, 由CGAAAACGG突变为GCGGCCGCG, 测序成功. 高效表达的红色融合蛋白, 野生型主要定位于细胞核; 而突变型主要定位于细胞质. 野生型P21抑制HepG2细胞的生长; 突变型促进HepG2细胞的生长, 二者差异具有统计学意义(P<0.01).
结论: P21的亚细胞定位, 对HepG2细胞增殖影响具有明显差异. 胞核P21抑制肿瘤生长, 而胞质P21促进肿瘤生长.
Keywords: P21; 核定位信号; 基因定点诱变; 真核表达载体; HepG2细胞