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世界华人消化杂志. 2008-11-08; 16(31): 3505-3509
Published online 2008-11-08. doi: 10.11569/wcjd.v16.i31.3505
Published online 2008-11-08. doi: 10.11569/wcjd.v16.i31.3505
含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定
陈漉, 刘妍, 迟宝荣, 吉林大学第一临床医院消化内科 吉林省长春市 130021
金宁一, 李霄, 刘立明, 贾鹏, 中国人民解放军军事医学科学院全军基因工程重点实验室 吉林省长春市 130062
高鹏, 吉林省人民医院血液科 吉林省长春市 130021
陆蕴松, 吉林大学第三医院骨科 吉林省长春市 130033
陈漉, 2006年吉林大学博士, 主要从事肿瘤基因治疗研究.
基金项目: 吉林省科技发展计划项目资助, No. 20060566.
作者贡献分布: 此课题由陈漉, 金宁一, 李霄, 刘立明, 贾鹏, 刘妍, 高鹏及迟宝荣设计; 研究过程由陈漉, 李霄, 刘立明, 贾鹏, 刘妍, 高鹏及陆蕴松操作完成; 数据分析由陈漉与李霄完成; 本论文写作由陈漉完成.
通讯作者: 金宁一, 130062, 吉林省长春市, 中国人民解放军军事医学科学院全军基因工程重点实验室. ningyij@163.com
电话: 0431-86985921 传真: 0431-87983322
收稿日期: 2008-09-04
修回日期: 2008-10-10
接受日期: 2008-10-14
在线出版日期: 2008-11-08
修回日期: 2008-10-10
接受日期: 2008-10-14
在线出版日期: 2008-11-08
Abstract
目的: 构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒, 为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.
方法: 利用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切质粒pVAX1-Apoptin, 获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA, 构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin. 利用PacⅠ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞, 分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Western blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定, 并测定所获得重组病毒的滴度.
结果: 所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录, 表达产物的相对分子质量约为13 kDa, 与CVA阳性对照一致; 所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白, 该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性, 重组病毒滴度为1011 PFU/L.
结论: 成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒, 所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.
Keywords: Apoptin基因; 腺病毒载体; 基因治疗; 逆转录-聚合酶链反应; 免疫印迹法