基础研究
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世界华人消化杂志. 2008-11-08; 16(31): 3498-3504
Published online 2008-11-08. doi: 10.11569/wcjd.v16.i31.3498
pGL3-Basic-COX-2-promoter报告基因重组质粒的构建及其功能鉴定
李琦, 周利红, 王炎, 孙珏, 高虹, 范忠泽
李琦, 周利红, 王炎, 孙珏, 高虹, 范忠泽, 上海中医药大学附属普陀医院肿瘤科 上海市 200062
李琦, 上海中医药大学, 博士, 副教授, 副主任医师, 主要从事中西结合治疗肿瘤的临床及实验研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30600844; 上海市教委第五期重点学科资助项目, No. J50304.
作者贡献分布: 李琦与范忠泽对此文所作的贡献均等, 本研究由李琦与范忠泽设计; 研究过程由李琦, 周利红, 王炎, 孙珏及高虹共同完成; 研究所用新试剂及分析工具由李琦与范忠泽提供; 数据分析由孙珏与高虹完成; 本论文写作由李琦, 周利红及王炎完成.
通讯作者: 范忠泽, 200062, 上海市兰溪路164号, 上海中医药大学附属普陀医院肿瘤科. lzwf@hotmail.com
电话: 021-62572723-4306 传真: 021-52665957
收稿日期: 2008-08-15
修回日期: 2008-10-06
接受日期: 2008-10-14
在线出版日期: 2008-11-08
Abstract

目的: 构建COX-2基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒pGL3-Basic-COX-2-promoter, 并进行功能鉴定.

方法: 根据已知人的COX-2基因启动子序列设计两端引物, 扩增人基因组DNA中的COX-2启动子. 载体质粒pGL3-Basic和COX-2启动子分别用限制性内切酶Hind Ⅲ和BglⅡ双酶切, 将COX-2基因启动子插入到pGL3-Basic报告载体中. 构建的pGL3-Basic-COX-2-promoter重组质粒和内参质粒pRL-SV40瞬时共转染胃癌MKN45细胞, 加入100倍细胞数量的H. pylori共培养不同时间后, 检测双荧光素酶的活性.

结果: 成功构建COX-2基因启动子重组质粒pGL3-Basic-COX-2-promoter, 质粒测序及酶切结果完全正确. 瞬时转染实验显示, COX-2启动子在MKN45细胞中的转录表达随时间的变化而升高, 转染后40 h的双报告基因活性是转染后8 h的3.5倍(P<0.01); 加入H. pylori共培养后, 同时间点的荧光素酶活性明显升高(P<0.05或0.01), 转染后40 h的活性是转染后8 h的5倍(P<0.01).

结论: pGL3-Basic-COX-2-promoter在胃癌MKN45细胞中能被转录激活, 加入H. pylori刺激后COX-2活性显著增强, pGL3-Basic-COX-2-promoter可以用来鉴定和检测细胞中COX-2的水平.

Keywords: 环氧合酶2; 启动子; 质粒; 幽门螺杆菌; 双荧光素酶