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世界华人消化杂志. 2008-09-18; 16(26): 2940-2945
Published online 2008-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v16.i26.2940
Published online 2008-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v16.i26.2940
靶向mcl-1基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选
李银鹏, 侯晓华, 华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科 湖北省武汉市 430030
朱惠明, 暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院消化内科 广东省深圳市 518020
李银鹏, 华中科技大学同济医学院在读博士, 主要从事消化系统肿瘤基因治疗研究.
作者贡献分布: 本课题由李银鹏, 朱惠明及侯晓华设计; 研究过程由李银鹏与朱惠明完成; 论文写作由李银鹏, 朱惠明及侯晓华完成.
通讯作者: 侯晓华, 430022, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科. houxh@public.wh.hb.cn
电话: 027-67119890
收稿日期: 2008-06-26
修回日期: 2008-08-21
接受日期: 2008-08-26
在线出版日期: 2008-09-18
修回日期: 2008-08-21
接受日期: 2008-08-26
在线出版日期: 2008-09-18
Abstract
目的: 构建靶向髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1, mcl-1)的shRNA的真核表达质粒, 并筛选出沉默mcl-1基因效果最明显的shRNA表达质粒.
方法: 设计3对针对mcl-1基因不同位点的shRNA片段, 构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(shRNA1-3)并行酶切鉴定和测序分析. 然后通过脂质体将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2中, 48 h后测定转染率, 并分别采用RT-PCR及Western blot检测mcl-1 mRNA和蛋白表达情况.
结果: 重组质粒经酶切鉴定与测序证实构建成功. 质粒在HepG2细胞中的转染率约为64%. shRNA1-3导入HepG2细胞48 h后, mcl-1 mRNA水平和蛋白水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(0.61±0.02, 0.56±0.02, 0.46±0.01 vs 0.97±0.01, 0.95±0.00; 0.53±0.01, 0.48±0.03, 0.36±0.01 vs 0.90±0.03, 0.88±0.01, 均P<0.01). 与shRNA1和shRNA2相比, shRNA3对mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强(52.6% vs 36.3%, 42.9%; 63.2% vs 41.5%, 49.6%, 均P<0.01).
结论: 成功构建并筛选出的靶向mcl-1的shRNA真核表达质粒对肝癌细胞HepG2内的mcl-1表达具有明显抑制作用.
Keywords: 髓细胞白血病基因-1; 肝细胞癌; RNA干扰; 短发夹状RNA