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世界华人消化杂志. 2008-07-28; 16(21): 2395-2398
Published online 2008-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i21.2395
Published online 2008-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v16.i21.2395
人BRAF野生型及V600E突变型真核表达载体的构建及表达
程张军, 石欣, 汤永辉, 高乃荣, 东南大学附属中大医院普外科 江苏省南京市 210009
基金项目: 国家自然科学基金面上项目, No. 30500491.
作者贡献分布: 此课题由石欣与程张军设计; 研究过程由程张军与汤永辉操作完成; 全程由石欣与高乃荣指导; 本论文写作由程张军, 石欣及汤永辉完成.
通讯作者: 石欣, 210009, 江苏省南京市鼓楼区丁家桥87号, 东南大学附属中大医院普外一科. shixined@hotmail.com
电话: 025－83272195
收稿日期: 2008-04-07
修回日期: 2008-05-15
接受日期: 2008-05-27
在线出版日期: 2008-07-28
修回日期: 2008-05-15
接受日期: 2008-05-27
在线出版日期: 2008-07-28
Abstract
目的: 构建BRAF野生型和V600E突变型真核表达载体; 转染并筛选稳定表达BRAF的胰腺癌细胞株, 为探讨BRAF V600E突变在胰腺癌发生发展中的作用提供合适的细胞模型.
方法: 将BRAF野生型及V600E突变型cDNA克隆于真核表达载体pCMV-Myc中, 构建pCMV-Myc-BRAFW及pCMV-Myc-BRAFV600E重组质粒, 酶切鉴定、测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染胰腺癌细胞Panc-1, 经G418培养筛选获得抗性细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot鉴定野生型和V600E突变型BRAF基因在Panc-1细胞中的表达.
结果: 酶切鉴定和序列分析证实, 重组克隆pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAFV600E序列正确, RT-PCR和Western blot结果显示G418筛选获得的转基因Panc-1细胞稳定表达BRAF和BRAF V600E.
结论: 成功构建了pCMV-Myc-BRAFW和pCMV-Myc-BRAFV600E真核表达载体, 建立了稳定表达BRAF和BRAF V600E的胰腺癌细胞株.
Keywords: BRAF; 胰腺癌; 逆转录聚合酶链式反应; Western blot; 克隆; 真核表达