基础研究
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世界华人消化杂志. 2007-08-18; 15(23): 2482-2486
Published online 2007-08-18. doi: 10.11569/wcjd.v15.i23.2482
靶向XIAP的shRNA重组质粒的构建
吴小力, 张鹏, 张琼, 姚津剑, 林菊生
吴小力, 张琼, 姚津剑, 林菊生, 华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科 湖北省武汉市 430030
张鹏, 华中科技大学同济医学院附属同济医院普通外科 湖北省武汉市 430030
吴小力, 2000年华中科技大学同济医学院硕士, 主治医师, 主要从事消化系统疾病的研究.
通讯作者: 林菊生, 430030, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科. jslin@tjh.tjmu.edu.cn
收稿日期: 2007-04-26
修回日期: 2007-08-03
接受日期: 2007-08-28
在线出版日期: 2007-08-18
Abstract

目的: 设计以X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)为靶向的shRNA, 构建携带此shRNA的重组质粒, 检测其抑制XIAP表达的效应, 筛选RNA干扰作用最强的shRNA片段.

方法: 设计4对针对XIAP基因不同位点的shRNA片段, 构建携带此shRNA片段的真核表达载体psiRNA-Hhneo-XIAP, 通过脂质体介导的方法将重组质粒转染到肝癌细胞株HepG2细胞中. 采用逆转录酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹(Western blotting)方法检测XIAP的mRNA及蛋白表达情况, 比较转染前后其表达差异, 以判断各shRNA的干扰效应.

结果: 成功构建含shRNA片段的重组质粒. 经质粒测序证实, 插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致. 重组质粒转染HepG2细胞后, XIAP基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调, 其中以1号重组质粒效应最强. shRNA作用48 h后, 对HepG2细胞中XIAP mRNA和蛋白的抑制率与3, 4号重组质粒相比, 均具有显著性差异(mRNA: 94.5% vs 81.5%, 82.6%, 均P<0.01; 蛋白: 92.6% vs 80.7%, 82.9%, 均P<0.01).

结论: 成功构建了携带以XIAP为靶向的shRNA的重组质粒, 其对肝癌细胞内XIAP的表达具有显著抑制效应.

Keywords: X染色体连锁凋亡抑制蛋白; 短发夹状RNA; 肝癌; 逆转录聚合酶链式反应; 免疫蛋白印迹